[發明專利]水產品中金黃色葡萄球菌的雙重PCR-DHPLC檢測方法

有效

• 申請號: 201110402451.4
• 申請日: 2011-12-07
• 公開（公告）號: CN102399897A
• 公開（公告）日: 2012-04-04
• 發明（設計）人: 周向陽;萬婧;沈飚;胡興娟;邵宏宏;張靜;顏建波
• 申請（專利權）人: 中華人民共和國舟山出入境檢驗檢疫局
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/14;G01N30/02;C12R1/445
• 代理公司: 寧波誠源專利事務所有限公司 33102
• 代理人: 袁忠衛;景豐強

1.一種水產品中金黃色葡萄球菌的雙重PCR-DHPLC檢測方法，其特征在于包括如下步驟：

①金黃色葡萄球菌培養，將待測水產樣品與增菌液混合，進行培養；

②金葡菌基因組DNA的提取；

③引物的設計：

根據Genbank中金葡菌的sea和nuc基因序列，利用Primer5.0軟件設計2對特異性引物，如下：

sea-F：5’-AGTCTGAATTGCAGGGAAC-3’，

sea-R：5’-CACCACCATACATACAAGC-3’；

nuc-F：5’-CTTGCTATGATTGTGGTAGC-3’，

nuc-R：5’-CTAGCAAGTCCCTTTTCCAC-3’；

④以金葡菌基因組DNA為模板，進行雙重PCR擴增；

⑤PCR產物的DHPLC檢測，得到DHPLC峰型圖譜，供分析鑒定。

2.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于步驟①中所述的金黃色葡萄球菌培養如下：取樣品1mL與10mL?10％氯化鈉胰酪胨大豆肉湯混合，于36℃±1℃培養18h～24h，其中，待測樣品與增菌液之間體積配比為1∶10。

3.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于步驟①中所述的金葡菌基因組DNA的提取，如下：

取培養后的增菌液1mL，離心，去除上清，得到沉淀用溶葡菌酶進行預處理1h；然后按照細菌DNA提取試劑盒的說明書提取金葡菌基因組DNA。

4.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于步驟④雙重PCR擴增條件如下：

雙重PCR反應體系：含20mM?Mg²⁺的10×PCR?Buffer?5μL，10mM的dNTP?2μL，兩對50μM的引物各0.5μL，2u·μL^-1的Ex?Taq酶1μL，模板DNA?2μL，最后用ddH₂0將反應總體積補足至50μL；

雙重PCR反應程序：95℃預變性5min；95℃變性45s，60℃退火1min，72℃延伸1min，35個循環，72℃延伸10min，4℃保存。

5.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于步驟⑤中DHPLC檢測如下：

PCR產物上樣量5μL；

色譜柱為PS-DVB?C₁₈DNASep色譜柱，并且，該色譜柱滿足4.6mm×50mm，3μm；

柱溫為50℃；

流速為0.9mL/min；

流動相：緩沖溶液A體積分數為50.2％，緩沖溶液B體積分數為49.8％；緩沖液A為50mL?TEAA、250μL乙腈，去離子水定容至1000mL，緩沖液B為50mL?TEAA、250mL乙腈，去離子水定容至1000mL；

檢測器為熒光檢測器，光源：150W?Xenon燈；激發譜帶寬：15nm；發射譜帶寬：15.3nm；檢測靈敏度：在波長350nm積分2s；

系統自動按照線性遞增的方式將DNASep柱上的DNA分子洗脫下來，在波長260nm處讀取吸光值，經系統自動處理后，形成DHPLC峰型圖譜。