[發明專利]一種用于檢測土壤中煙草黑脛病菌的方法

無效

• 申請號: 201110402300.9
• 申請日: 2011-12-07
• 公開（公告）號: CN102399896A
• 公開（公告）日: 2012-04-04
• 發明（設計）人: 張成省;闞光鋒;張玉芹;王曉飛;孔凡玉;王靜;馮超;王新偉;李霞;陳雪
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院煙草研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/06
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于植物病蟲害檢疫領域，尤其涉及一種用于檢測土壤中煙草黑脛病菌的方法。

背景技術

煙草是一年生草本植物，屬于茄科(Solanaceae)煙草屬(Nicotiana)，在世界上分布廣泛，目前發現的煙草屬有66個種。2010年，全國煙草行業實現稅利超過6000億元。煙草黑脛病是煙草生產上最具毀滅性的侵染性病害之一，在我國常年發病率維持在10-15％，發病面積約76372hm2，造成的年損失產量約2869.26Kg，經濟損失達1.23億元人民幣以上。目前的研究表明，土壤中黑脛病病原菌的數量與煙草黑脛病的發生密切相關。因此，檢測土壤中煙草黑脛病菌的數量，可以及早進行預防，降低黑脛病的發生。

目前常用的土壤中黑脛病菌的檢測方法主要是通過菌體培養和普通的PCR方法，這兩種方法具有準確性低、費時和重復性差等缺點。而熒光定量PCR(Real?time?fluorescent?quantitative?PCR，Real-time?Q-PCR)方法是一種靈敏度高、穩定性好、省時的檢測技術，并具有自動化的特點，檢測結果可在10～1012拷貝范圍，在國內外病原微生物的檢測中具有廣泛的應用。通過該方法對土壤中的煙草黑脛病菌進行熒光定量PCR檢測，同時參考標準曲線，可以檢測土壤中煙道黑脛病菌的數量，為預防煙草黑脛病的發生提供了前提和保障。

發明內容

本發明提供了一種用于檢測土壤中煙草黑脛病菌的方法，旨在解決目前常用的土壤中黑脛病病菌的檢測方法主要是通過菌體培養和普通的PCR方法，這兩種方法準確性低、費時和重復性差的問題。

本發明的目的在于提供一種用于檢測土壤中煙草黑脛病菌的方法，該方法包括以下步驟：

該方法包括以下步驟：

取低溫保存的煙草黑脛病病菌和其他真菌進行培養，并利用CTAB法提取基因組DNA；

提取煙草黑脛病病菌土壤的總DNA；

根據基因庫中煙草黑脛病病菌的基因序列設計引物，并進行引物特異性PCR擴增驗證；

檢測、分析引物的靈敏度并制作熒光定量PCR標準曲線；

利用熒光定量PCR標準曲線，對不同煙草黑脛病發病程度土壤的DNA進行定量分析。

本發明提供的用于檢測土壤中煙草黑脛病菌的方法，對土壤中煙草黑脛病菌進行DNA提取以及分子檢測，省去了傳統的分離培養的方法，在時間上大大縮短了檢測周期，整個檢測0.5天即可完成，與普通PCR檢測方法相比，無需后續的處理過程，并且能對結果進行實時監測，設計的引物是基于病原菌ITS的易變區域設計的，相近物種擴增時沒有相應條帶，所得產物的大小為172bp，經與近似菌種擴增驗證，特異性好，適于熒光定量PCR反應條件，增加了土壤中總DNA的提取方法，在土壤總DNA提取緩沖液加入了2％的PVP，有效地去除了土壤中部分雜質的污染，減少了對PCR效果的影響，大大提高了熒光定量PCR的檢測靈敏度，同時熒光定量PCR的體系及反應條件根據所設計引物大小摸索條件所得，操作簡單，檢測靈敏度高，可以達到2fg/μl，土壤中只有一個病原孢子的存在，即可檢出。

附圖說明

圖1是本發明實施例提供的用于檢測土壤中煙草黑脛病菌的方法的實現流程圖；

圖2是本發明實施例提供的利用CTAB法提取基因組DNA的實現方法的流程圖；

圖3是本發明實施例提供的提取煙草黑脛病病菌土壤的總DNA的實現方法的流程圖。

具體實施方式

為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對本發明進行進一步的詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定發明。

圖1示出了本發明實施例提供的用于檢測土壤中煙草黑脛病菌的方法的實現流程。

該方法包括以下步驟：

在步驟S101中，取低溫保存的煙草黑脛病病菌和其他真菌進行培養，并利用CTAB法提取基因組DNA；

在步驟S102中，提取煙草黑脛病病菌土壤的總DNA；

在步驟S103中，根據基因庫中煙草黑脛病病菌的基因序列設計引物，并進行引物特異性PCR擴增驗證；

在步驟S104中，檢測、分析引物的靈敏度并制作熒光定量PCR標準曲線；

在步驟S105中，利用熒光定量PCR標準曲線，對不同煙草黑脛病發病程度土壤的DNA進行定量分析。

在本發明實施例中，取低溫保存的煙草黑脛病病菌和其他真菌進行培養進一步包括：