[發明專利]一種用于檢測土壤中煙草黑脛病菌的方法

無效

• 申請號: 201110402300.9
• 申請日: 2011-12-07
• 公開（公告）號: CN102399896A
• 公開（公告）日: 2012-04-04
• 發明（設計）人: 張成省;闞光鋒;張玉芹;王曉飛;孔凡玉;王靜;馮超;王新偉;李霞;陳雪
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院煙草研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/06
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種用于檢測土壤中煙草黑脛病菌的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：

取低溫保存的煙草黑脛病病菌和其他真菌進行培養，并利用CTAB法提取基因組DNA；

提取煙草黑脛病病菌土壤的總DNA；

根據基因庫中煙草黑脛病病菌的基因序列設計引物，并進行引物特異性PCR擴增驗證；

檢測、分析引物的靈敏度并制作熒光定量PCR標準曲線；

利用熒光定量PCR標準曲線，對不同煙草黑脛病發病程度土壤的DNA進行定量分析。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述取低溫保存的煙草黑脛病病菌和其他真菌進行培養進一步包括：

PDA液體培養基28℃過夜培養后，取1.5mL菌液，收集菌絲體，雙蒸水洗滌2次。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述利用CTAB法提取基因組DNA的實現方法為：

加入500μl的CTAB溶液，液氮中冷卻30s，立即放入65℃水浴中30s，重復3次；

加入玻璃珠漩渦振蕩5min，65℃保溫20min，期間搖動一次；

加入酚、氯仿、異戊醇，體積比25∶24∶1，12000r/min離心10min，上清液中加入氯仿、異戊醇，體積比24∶1，12000r/min離心10min；

取上清，加入2/3倍體積的-20℃預冷異丙醇沉淀，靜置約30min；

低轉速離心，沉淀用70％乙醇漂洗2次，再用無水乙醇漂洗1次，吹干，重懸于100ul雙蒸水中，-20℃保存備用。

4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述提取煙草黑脛病病菌土壤的總DNA的實現方法為：

制備分生孢子懸浮液并接種土壤，每份土壤3個重復；

土壤樣品中加入DNA提取緩沖液，37℃溫浴30min，每5min混勻；

加入20％SDS，終濃度為2％，65℃水浴2h，每10min顛倒混勻，6000g室溫離心10min；

加入酚、氯仿、異戊醇，三者體積比為25∶24∶1，12000r/min離心10min，上清液中加入氯仿、異戊醇，二者體積比為24∶1，12000r/min離心10min；

取上清，加入2/3倍體積的-20℃預冷異丙醇沉淀，靜置約30min；

低轉速離心，沉淀用70％乙醇漂洗2次，再用無水乙醇漂洗1次，吹干，重懸于100ul雙蒸水中，-20℃保存備用。

5.如權利要求1或4所述的方法，其特征在于，所述DNA提取緩沖液中加入了2％的PVP，用于去除土壤中部分雜質的污染、減少對PCR效果的影響、提高熒光定量PCR的檢測靈敏度。

6.如權利要求1或4所述的方法，其特征在于，所述土壤總DNA提取緩沖液的組成為：

pH值為8.0的100mmol/L?Tris-HCl，100mmol/L?EDTA-Na2，2％PVP，1.5mol/L?NaCl，1％CTAB，125μg/mL蛋白酶K。

7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述根據基因庫中煙草黑脛病病菌的基因序列設計引物，并進行引物特異性PCR擴增驗證的實現方法為：

根據NCBI數據庫中煙草黑脛病病菌的18S?rDNA基因序列，利用Primer5.0設計熒光定量PCR特異引物SP：5′-TGAAGAACGCTGCGAACTGC-3′，AP：5’-CTGACATCTCCTCCACCGACTA-3′，擴增目的片段長度為172bp；

將提取的煙草黑脛病病原菌基因組DNA和其他致病真菌的基因組DNA進行引物特異性檢測。

8.如權利要求1或7所述的方法，其特征在于，該方法中設計引物特異性好，相近物種擴增時沒有相應條帶，所得產物的大小為172bp，適于熒光定量PCR反應條件。