[發明專利]一種苷元型大豆異黃酮的制備方法

無效

• 申請號: 201110401680.4
• 申請日: 2011-12-07
• 公開（公告）號: CN103146774A
• 公開（公告）日: 2013-06-12
• 發明（設計）人: 李丹;李曉磊
• 申請（專利權）人: 長春大學;李丹;李曉磊
• 主分類號: C12P17/06
• 分類號: C12P17/06;C12R1/01
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種苷元型大豆異黃酮的制備方法，尤其是指利用一種極端熱穩定、耐有機溶劑的beta-葡萄糖苷酶、在高溫含水的有機溶劑中、水解大豆異黃酮糖苷的糖苷鍵，制備苷元型大豆異黃酮。

背景技術

大豆異黃酮對人體具有較弱的雌激素活性，可以緩解婦女更年期不適癥、預防骨質疏松癥、降低乳腺癌和前列腺癌等腫瘤疾病的發生率。目前，大豆異黃酮類保健食品已被廣泛用于雌激素替代療法，以補充絕經期女性體內的雌激素。

大豆異黃酮有糖苷型和苷元型二種分子結構形式。苷元型大豆異黃酮在人體內的生物利用度較高，他能夠直接被人體腸道吸收進入血液，血藥濃度高、峰值時間短。糖苷型大豆異黃酮的生物利用度較低，他不能被人體腸道直接吸收，只有少部分在腸道菌群分泌酶的作用下，被水解下葡萄糖殘基，轉變成苷元形式，才能被吸收。

大豆及其醇提物中的異黃酮主要是糖苷型。為了提高大豆異黃酮的口服吸收率，常常使用beta-葡萄糖苷酶預先在體外將低大豆異黃酮糖苷含量的醇提物轉化為大豆異黃酮苷元。然而大豆異黃酮的水溶性較低(例如在室溫下，染料木苷的水溶性小于25μM)，至今仍不能直接酶法轉化大豆異黃酮糖苷含量在40％(w/w)以上的醇提物。

發明內容

本發明采用嗜熱古細菌beta-葡萄糖苷酶，在高溫和含水的有機溶劑中催化高濃度的糖苷型大豆異黃酮水解，從而制備苷元型大豆異黃酮(圖1)。

本項發明所使用的大豆異黃酮糖苷，包括染料木苷(genistin)、大豆黃苷(daidzin)、黃豆黃苷(glycitin)及其混合物，總糖苷含量在40％(w/w)以上。

本項發明所使用的有機溶劑是二甲基亞砜；二甲基亞砜能與水互溶，并且大豆異黃酮在含水的二甲基亞砜里具有較高的溶解度。

本項發明所使用的極端熱穩定、耐有機溶劑的beta-葡萄糖苷酶(EC?3.2.1.21)，屬于碳水化合物活性酶GH3家族，產自含有外源依賴熱絲菌Thermofilum?pendens?beta-葡萄糖苷酶基因(Tpbgl)的大腸桿菌。即采用常規的基因克隆法(Sambrook?and?Russell，Molucular?Cloning：A?Laboratory?Manual，third?edition.Cold?Spring?Harbor?Laboratory?Press.2001.ISBN?978-087969577-4)：以1μL依賴熱絲菌Thermofilum?pendens基因組DNA為模版(10ng)，加入8μL四種dNTP混合物(每種2.5mM)、2μL×10μM正向引物(Tpbgl-NdeI：5′-GGGCATATGAGGGGAAGGGGCCCTG-3′)、2μL×10μM反向引物(Tpbgl-HindIII：5′-CCGAAGCTTTCAGGGCGCGAATCTCA-3′)、20μL緩沖液(buffer?Mg²⁺plus)、66μL無菌蒸餾水和1μLDNA聚合酶(HS?DNA?polymerase，2.5U/μL)，在變性溫度98℃、退火溫度62℃、延伸溫度72℃的條件下，進行聚合酶鏈式反應，擴增出2.1kb的Tpbgl基因；將以限制性內切酶NdeI和HindIII分別雙消化的Tpbgl基因和p6×His119載體混和，加入T4DNA聯接酶，構建重組質粒p6×His119-Tpbgl，然后轉化大腸桿菌E.coli?MC1061[F-，araD139，recA13，Δ(araABC-leu)7696，galU，galK?lacX74，rpsL，thi，hsdR2，and?mcrB]；基因重組大腸桿菌的培養、beta-葡萄糖苷酶的制備、純化和活性測定的方法為文獻“Choi，Ki-Won?et?al.Modulation?of?the?Regioselectivity?of?a?Thermotoga?neapolitana?β-Glucosidase?by?Site-Directed?Mutagenesis.Journal?of?Microbiology?and?Biotechnology.2008，18(5)：901-907”中所報道的方法。采用上述方法所得到的依賴熱絲菌Thermofilum?pendens?beta-葡萄糖苷酶，是一種新型的基因重組嗜熱古細菌beta-葡萄糖苷酶；此酶水解對硝基苯-β-D-吡喃葡糖苷的最適催化反應溫度是90℃、最適催化反應pH是3.5；并且，在10-60％(v/v)的二甲基亞砜中，仍具有較高的水解活性。由于高溫和含水的二甲基亞砜有助于增強大豆異黃酮糖苷的溶解度，所以在依賴熱絲菌Thermofilum?pendens?beta-葡萄糖苷酶催化的水解反應中，可以使用較高底物濃度的大豆異黃酮糖苷。