[發(fā)明專利]一種鑒定日本金線魚的分子生物學(xué)方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110397428.0
• 申請(qǐng)日: 2011-12-02
• 公開（公告）號(hào): CN103131767A
• 公開（公告）日: 2013-06-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 袁萬安;于曉軍;游翠紅
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種鑒定日本金線魚的分子生物學(xué)方法，其特征在于它包括兩大步驟：(1)確定日本金線魚的特異引物；(2)日本金線魚種類的鑒定。

步驟(1)又包括下面幾個(gè)步驟：

1.1設(shè)計(jì)并篩選出一對(duì)鱸形目魚類的核糖體5.8SrRNA和28SrRNA基因間的轉(zhuǎn)錄間隔子DNA片段的特異引物對(duì)作為鱸形目魚類通用引物對(duì)，該引物對(duì)為：正向引物5′-gtcgatgaagaacgcagcta-3′，反向引物5′-gtcttctttccccgctgatt-3′；

1.2用步驟1.1得到的通用引物對(duì)，對(duì)鱸形目中常見珍稀魚類的DNA模板樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；

1.3將步驟1.2得到的常見珍稀鱸形目魚類的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果選出每種常見珍稀鱸形目魚類與其它常見珍稀鱸形目魚類有差異的DNA片段；

1.4從步驟1.3中所選出DNA片段區(qū)域內(nèi)，為日本金線魚設(shè)計(jì)并篩選出一條特異引物，該特異引物為：5′-atttgacggcctaagatcta-3′；

1.5用步驟1.1所得到的魚類通用引物對(duì)中的一條引物與步驟1.4得到的日本金線魚的特異引物配對(duì)，構(gòu)成日本金線魚的特異引物對(duì)；

1.6用步驟1.5所得到的日本金線魚的特異引物對(duì)對(duì)鱸形目中常見珍稀魚類的DNA模板樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

1.7將步驟1.6所得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，從日本金線魚的DNA模板樣本中擴(kuò)增得到的產(chǎn)物電泳后能得到顯著的條帶，而對(duì)其它常見珍稀鱸形目魚類的DNA模板樣本擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后則沒有明顯的條帶產(chǎn)生，從而得到日本金線魚的鑒定標(biāo)準(zhǔn)電泳條帶。

步驟(2)又包括下面幾個(gè)步驟：

2.1將步驟1.1中所得的通用引物對(duì)和步驟1.4中得到的日本金線魚的特異引物相混合，構(gòu)成混合引物；

2.2采用步驟2.1所得到的混合引物，對(duì)需要鑒別的魚類DNA樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

2.3將步驟2.2所得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，如需要鑒別的魚類為日本金線魚，則電泳結(jié)果會(huì)得到兩條條帶，一條是通用引物擴(kuò)增產(chǎn)物，一條是日本金線魚特異引物擴(kuò)增產(chǎn)物；而其它鱸形目魚類樣本只有一條由通用引物對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的帶，非鱸形目魚類樣本則沒有電泳條帶。

2.依據(jù)權(quán)利要求1中所述的一種鑒定日本金線魚的分子生物學(xué)方法，其特征在于在所述步驟1.2中，對(duì)鱸形目中常見的珍稀魚類的DNA模板分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，鱸形目中常見的珍稀魚類是指：短尾大眼鯛、真鯛、平鯛、黑鯛、黃鰭鯛、銀鯧、卵形鯧鲹、日本金線魚、金線魚、花鱸、鱖魚、大黃魚、赤點(diǎn)石斑魚、細(xì)鱗三梭魚、尖吻鱸、發(fā)光鯛、長(zhǎng)尾大眼鯛、軍曹魚、藍(lán)圓鲹、烏鯧、短體銀鱸等。

3.依據(jù)權(quán)利要求1中所述的一種鑒定日本金線魚的分子生物學(xué)方法，其特征在于步驟1.2、1.6和2.2中，提取魚類樣本的DNA時(shí)，可以按以下常規(guī)方法進(jìn)行提?。篴、取魚類新鮮組織，如魚的肌肉、魚鱗、魚鰭、魚卵、魚血、魚類粘液等，置于1.5ml的離心管消化過夜，用酚-氯法提取DNA；b、魚類烘干或曬干制品，魚類罐頭制品，可以直接取樣，同新鮮組織一樣提取DNA；c、對(duì)于用95％酒精保存的魚類組織樣本，需用雙蒸水浸泡過夜，再用酚-氯法提取DNA。

4.依據(jù)權(quán)利要求1中所述的一種鑒定日本金線魚的分子生物學(xué)方法，其特征在于在步驟1.2、1.6和2.2中，對(duì)魚類DNA樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，PCR反應(yīng)體系中的各種成份及其濃度如下：DNA樣本(3μl)，DDH₂O(22.0μl)，dNTP(200μM)，10×緩沖液(3.6μl)，市售Taq酶(3U)，MgCl₂(2.25mM)，其中各類引物的添加量均為40nM。整個(gè)復(fù)合擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)如下：94℃預(yù)變性6分鐘，94℃變性30秒，64℃復(fù)性60秒，72℃延伸60秒，循環(huán)次數(shù)34次；72℃延伸10分鐘。

5.依據(jù)權(quán)利要求1中所述的一種鑒定日本金線魚的分子生物學(xué)方法，其特征在于在步驟1.7和2.3中，進(jìn)行瓊脂糖凝膠時(shí)，將樣本擴(kuò)增產(chǎn)物3μl、分子量馬克2μl以及凝膠載樣緩沖液2μl加入到10ml的2％的瓊脂糖凝膠溶液(每100ml瓊脂糖凝膠溶液中加入10u的11‰的溴乙淀)處理30-40分鐘。