[發(fā)明專利]一種鑒定日本金線魚的分子生物學(xué)方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110397428.0
• 申請(qǐng)日: 2011-12-02
• 公開（公告）號(hào): CN103131767A
• 公開（公告）日: 2013-06-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 袁萬安;于曉軍;游翠紅
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種鑒定常見珍稀鱸形目魚類的方法，特別涉及一種鑒定日本金線魚的分子生物學(xué)方法。

背景技術(shù)

保護(hù)生物多樣性，就是保護(hù)人類自己。由于水體生態(tài)環(huán)境的特殊性和大多數(shù)水產(chǎn)動(dòng)物一直是人們捕捉的對(duì)象，魚類生物多樣性比陸生動(dòng)物多樣性顯得更為脆弱，承受的壓力更大。保護(hù)好魚類種質(zhì)資源，就是保護(hù)人類生存所必須的水產(chǎn)動(dòng)物蛋白的生產(chǎn)源泉。魚類資源是一種可更新的資源，只要利用得當(dāng)，就可取之不盡，經(jīng)久不衰，但如果酷捕濫捕，也可發(fā)生資源枯竭或個(gè)體變小、質(zhì)量降低。捕撈并不是一個(gè)消極因素，只要捕撈合理，它可使魚類種群產(chǎn)生最大的生產(chǎn)量，人們可獲得最大持續(xù)量。全世界約有10億人以魚類為主要的蛋白質(zhì)來源，但同農(nóng)作物及畜禽類不同的是，目前，人類所消費(fèi)的魚類數(shù)量的80％以上依然來自天然捕撈產(chǎn)品。在全世界水產(chǎn)動(dòng)物，如魚類中，只有少數(shù)種類已用于養(yǎng)殖，極大多數(shù)種類的養(yǎng)殖潛力尚待評(píng)估。據(jù)初步統(tǒng)計(jì)，僅中國，由于工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的迅猛發(fā)展以及生活水平提高后對(duì)水產(chǎn)品需求的劇增，水域生態(tài)系統(tǒng)處于持續(xù)增長的壓力之下，處于瀕危狀態(tài)和受到嚴(yán)重威脅的魚類有97種。

由于魚類分布范圍廣泛，地理差異，生態(tài)環(huán)境的不同，使得各個(gè)地區(qū)的種類不同。由于人們的生活水平的提高，對(duì)魚產(chǎn)品的需求猛增，于是產(chǎn)生了對(duì)魚類的過渡捕撈，亂捕亂撈時(shí)有發(fā)生，再加上人們?yōu)榱藵M足各種需要而對(duì)魚類生態(tài)環(huán)境造成的破壞，使許多魚種瀕臨滅絕。雖然我們采取了一些措施，例如每年設(shè)立禁魚期，發(fā)布魚類保護(hù)白皮書，但由于沒有強(qiáng)有力的執(zhí)法隊(duì)伍，主要是缺乏快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)、易于操作的魚類鑒別方法，所以遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到預(yù)期目的。

目前，常用的魚類鑒別方法主要是沿用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒別法，根據(jù)魚體各部位的形態(tài)特征，步驟繁多、操作繁瑣、工作量大、專業(yè)性強(qiáng)。其致命的弱點(diǎn)是要求魚體結(jié)構(gòu)完整，各個(gè)部位特征發(fā)育完全，肉眼可以觀察鑒別。這在幼小魚體、魚體破碎或腐敗等情況下，難以進(jìn)行鑒定，易于出錯(cuò)。近年來國內(nèi)外許多實(shí)驗(yàn)室開始采用線粒體DNA分型、限制性長度多態(tài)性、同工酶電泳、隨機(jī)引物擴(kuò)增多態(tài)性(RAPD)技術(shù)進(jìn)行魚類鑒別，但這些方便普遍同樣具有繁瑣費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、費(fèi)錢，不利于操作，可重復(fù)性差，誤差大等弊端。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種耗費(fèi)時(shí)間少、易于實(shí)驗(yàn)室操作、方便直觀的鑒定常見珍稀鱸形目類中日本金線魚的分子生物學(xué)方法。

該方法包括兩大步驟：(1)確定日本金線魚的特異引物；(2)日本金線魚種類的鑒定。

步驟(1)又包括下面幾個(gè)步驟：

1.1設(shè)計(jì)并篩選出一對(duì)鱸形目魚類的核糖體5.8SrRNA和28SrRNA基因間的轉(zhuǎn)錄間隔子DNA片段的特異引物對(duì)作為鱸形目魚類通用引物對(duì)，該引物對(duì)為：正向引物5′-gtcgatgaagaacgcagcta-3′，反向引物5′-gtcttctttccccgctgatt-3′；

1.2用步驟1.1得到的通用引物對(duì)，對(duì)鱸形目中常見珍稀魚類的DNA模板樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；

1.3將步驟1.2得到的常見珍稀鱸形目魚類的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果選出每種常見珍稀鱸形目魚類與其它常見珍稀鱸形目魚類有差異的DNA片段；

1.4從步驟1.3中所選出DNA片段區(qū)域內(nèi)，為日本金線魚設(shè)計(jì)并篩選出一條特異引物，該特異引物為：5′-atttgacggcctaagatcta-3′；

1.5用步驟1.1所得到的魚類通用引物對(duì)中的一條引物與步驟1.4得到的日本金線魚的特異引物配對(duì)，構(gòu)成日本金線魚的特異引物對(duì)；

1.6用步驟1.5所得到的日本金線魚的特異引物對(duì)對(duì)鱸形目中常見珍稀魚類的DNA模板樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

1.7將步驟1.6所得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，從日本金線魚的DNA模板樣本中擴(kuò)增得到的產(chǎn)物電泳后能得到顯著的條帶，而對(duì)其它常見珍稀鱸形目魚類的DNA模板樣本擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后則沒有明顯的條帶產(chǎn)生，從而得到日本金線魚的鑒定標(biāo)準(zhǔn)電泳條帶。

步驟(2)又包括下面幾個(gè)步驟：

2.1將步驟1.1中所得的通用引物對(duì)和步驟1.4中得到的日本金線魚的特異引物相混合，構(gòu)成混合引物；

2.2采用步驟2.1所得到的混合引物，對(duì)需要鑒別的魚類DNA樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增；