[發明專利]己烯雌酚單鏈抗體篩選方法及其用途

無效

• 申請號: 201110396891.3
• 申請日: 2011-12-05
• 公開（公告）號: CN103130893A
• 公開（公告）日: 2013-06-05
• 發明（設計）人: 寧保安;高志賢;彭媛;白家磊;柳明;孫思明;孫亞楠;張亦紅
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院衛生學環境醫學研究所
• 主分類號: C07K16/26
• 分類號: C07K16/26;C12N15/13;C12N15/10;C12N15/70;G01N33/74
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技術領域

本發明涉及一種己烯雌酚單鏈抗體的篩選方法，屬于生物技術領域，用于制備特異識別己烯雌酚的高效抗體與研制可以快速檢測己烯雌酚殘留的免疫速測試劑盒及治療相關疾病的用途中。

背景技術

己烯雌酚(Diethylstilbestrol，DES)是第一個口服有活性的人工合成非甾體雌激素物質。目前在臨床上主要用于治療雌激素低下癥及激素平衡失調引起的各種疾病以及用于治療卵巢功能不全或垂體功能異常引起的各種疾病。在獸醫臨床上，DES主要用于治療母豬乏情不孕、誘導母兔發情、治療產蛋雞停產、山羊育肥等。另外己烯雌酚在促進動物蛋白質的合成代謝、提高動物日增重和減少脂肪等方面效果明顯。但是，DES能夠在動物源性食品如肝臟、肌肉、蛋、奶中殘留，會在水源和土壤中富積，造成環境激素污染惡性循環，并通過食物鏈引發動物和人的癌變，引起少兒的發育早熟以及男性女性化等危害。現在國際癌癥研究機構已經確認DES是經胎盤致癌的，并且把它列為人類致癌物質。針對上述情況，發展檢測己烯雌酚殘留的簡便、快速、靈敏的方法是有效遏制濫用己烯雌酚的重要技術手段和維護法規制度的必要保障。免疫學分析方法檢測DES具有快速簡便的特點，而免疫分析方法檢測需要有DES的特異性抗體。但是DES是小分子半抗原，免疫原性不強，通過傳統的免疫動物的方法制備抗體較困難，制備的周期也較長。

基因工程抗體單鏈抗體(Singe?chain?variable?fragment，ScFv)具有低或無免疫原性、分子量小、組織穿透力強、成本低、可大規模生產等特點。目前，主要應用核糖體展示技術和噬菌體展示技術來篩選和制備單鏈抗體。核糖體展示技術是一種完全不依賴于細胞的體外展示技術，文庫庫容量遠遠大于噬菌體單鏈抗體文庫，此外核糖體展示技術還具有建庫和篩選方法簡便，便于引入突變和重組技術來提高靶標蛋白的親和力等優點。天然抗體庫的抗體基因來源于未經免疫的動物或人體B細胞。從理論上講，能夠代表所有初級B細胞含有的抗體基因的多樣性，使用任何抗原都可能從中篩選到相應的抗體，具有較強的通用性。利用核糖體展示技術篩選針對小分子半抗原抗體的研究較少，尤其是從天然抗體文庫中篩選更為少見。

發明內容

本發明的主要目的是提供一種潛在的檢測和醫學用抗己烯雌酚單鏈抗體。

本發明的第二個目的提供一種抗己烯雌酚單鏈抗體的制備方法。

本發明的第三個目的提供抗己烯雌酚單鏈抗體在制備檢測試劑盒中的用途。

本發明的技術方案概述如下：

本發明提供的抗己烯雌酚單鏈抗體是從核糖體展示鼠源天然單鏈抗體庫中篩選獲得的并進行了可溶性功能表達。

本發明提供的抗己烯雌酚單鏈抗體的制備方法為：

1.核糖體展示鼠源天然單鏈抗體庫的構建

從未經免疫的6-8周齡Balb/c、C57/BL6小鼠的脾細胞中提取總RNA，反轉錄合成cDNA第一鏈后，擴增VH、VL基因片段，大小分別為380bp，350bp左右；合成(G4S)3linker，經序列測定，與理論序列完全一致。利用SOE-PCR構建單鏈抗體文庫，大小為750bp，經序列比對，單鏈抗體的文庫中有約80％的單鏈抗體都可以正確翻譯，無移碼突變和致死突變，無終止密碼子；測序正確的單鏈抗體的互補決定區都為不同的CDR，其中氨基酸序列變化多樣，說明構建的單鏈抗體文庫多樣性好，適合于進一步進行單鏈抗體的篩選。

擴增出大小為102bp核糖體展示元件T(包括T7啟動子，5’莖環，核糖體結合位點)和大小為298bp間隔序列P(噬菌體P蛋白部分序列)，含3’莖環，作為間隔序列，分別經序列測定，與理論序列完全一致。以重疊引物延伸法(splicing?by?overlap?extension，SOE)將T片段與scfv文庫連接，再將P片段與其拼接，構建成核糖體展示單鏈抗體文庫，大小為1200bp左右。

其中小鼠可以是其他品系小鼠，優選幾種品系小鼠的組合

其中連接VH、VL的鏈接linker為幾個G4S的組合，優選(G4S)₃

其中核糖體展示元件中的啟動子根據體外翻譯系統的不同可以為原核啟動子(T7啟動、tac啟動子等)，本發明優選原核啟動子特別是T7啟動子

2.抗己烯雌酚單鏈抗體的篩選