[發明專利]己烯雌酚單鏈抗體篩選方法及其用途

無效

• 申請號: 201110396891.3
• 申請日: 2011-12-05
• 公開（公告）號: CN103130893A
• 公開（公告）日: 2013-06-05
• 發明（設計）人: 寧保安;高志賢;彭媛;白家磊;柳明;孫思明;孫亞楠;張亦紅
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院衛生學環境醫學研究所
• 主分類號: C07K16/26
• 分類號: C07K16/26;C12N15/13;C12N15/10;C12N15/70;G01N33/74
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種抗己烯雌酚單鏈抗體，其特征在于可以特異識別小分子物質己烯雌酚

2.權利要求1抗己烯雌酚單鏈抗體制備方法，由如下步驟組成：

(1)核糖體展示鼠源天然單鏈抗體庫的構建

從未經免疫的6-8周齡Balb/c、C57/BL6小鼠的脾細胞中提取總RNA，反轉錄合成cDNA第一鏈后，擴增VH、VL基因片段，大小分別為380bp，350bp左右；合成(G4S)3linker，經序列測定，與理論序列完全一致。利用SOE-PCR構建單鏈抗體文庫，大小為750bp，經序列比對，單鏈抗體的文庫中有約80％的單鏈抗體都可以正確翻譯，無移碼突變和致死突變，無終止密碼子；測序正確的單鏈抗體的互補決定區都為不同的CDR，其中氨基酸序列變化多樣，說明構建的單鏈抗體文庫多樣性好，適合于進一步進行單鏈抗體的篩選。

擴增出大小為102bp核糖體展示元件T(包括T7啟動子，5’莖環，核糖體結合位點)和大小為298bp間隔序列P(噬菌體P蛋白部分序列)，含3’莖環，作為間隔序列，分別經序列測定，與理論序列完全一致。以重疊引物延伸法(splicing?by?overlap?extension，SOE)將T片段與scfv文庫連接，再將P片段與其拼接，構建成核糖體展示單鏈抗體文庫，大小為1200bp左右。

(2)抗己烯雌酚單鏈抗體的篩選

將構建的核糖體展示單鏈抗體文庫進行體外轉錄翻譯后，用己烯雌酚-BSA和己烯雌酚-磁珠作為抗原固相和液相交替篩選特異于己烯雌酚的單鏈抗體，通過改變Mg²⁺濃度將篩選得到的單鏈抗體-核糖體-mRNA三聯體解離，得到相應的mRNA，經過RT-PCR得到篩選后的DNA文庫。然后重復體外轉錄-體外翻譯-親和篩選-RT-PCR擴增過程，得到反復篩選兒輪的單鏈抗體DNA文庫。經過七輪核糖體展示篩選后，RT-PCR擴增得到的DNA條帶亮度明顯增加，說明篩選后的抗體文庫中抗原陽性的抗體得到了富集。

可以采用己烯雌酚-BSA進行固相篩選，還可以采用己烯雌酚-磁珠進行固相篩選，優選交叉篩選。

Mg²⁺濃度根據篩選條件的嚴謹性不同進行調整。

(3)抗己烯雌酚單鏈抗體的可溶性功能表達

將單鏈抗體基因與pTIG-TRX連接成表達載體，在大腸桿菌BL21(DE3)中表達，經SDS-PAGE和Western?Blot鑒定，在30KDa處有目的蛋白條帶，與理論蛋白大小一致，確定表達產物存在于破碎菌體后的上清液中。

抗體的表達可以采用原核表達載體如pBV220，pET系列載體，優選pTIG-TRX。

標簽蛋白可以為麥芽糖結合蛋白、6×組氨酸標簽等，優選6×組氨酸標簽。

(4)抗己烯雌酚單鏈抗體的純化與鑒定

將26株克隆子的表達上清液用間接ELISA和間接競爭ELISA分別鑒定，結果篩選出5株克隆子對DES有特異性的結合；用SPR分析篩出的一株30-3的單鏈抗體的親和力為3.79×10^-6M。利用Anti-His?tag親和層析柱對表達的單鏈抗體進行了純化。

3.權利要求2中所述小鼠可以是其他品系小鼠，優選幾種品系小鼠的組合。

4.權利要求2中所述連接VH、VL的鏈接linker為幾個G4S的組合，優選(G4S)₃。

5.權利要求2中所述核糖體展示元件中的啟動子根據體外翻譯系統的不同可以為原核啟動子(T7啟動、tac啟動子等)，優選原核啟動子特別是T7啟動子。

6.權利要求2中所述篩選方法可以采用己烯雌酚-BSA進行固相篩選，還可以采用己烯雌酚-磁珠進行固相篩選，優選在不同篩選輪次中采用不同方法交叉篩選。

7.權利要求2中所述抗體的表達可以采用原核表達載體如pBV220，pET系列載體，并根據載體不同選擇不同表達宿主，優選pTIG-TRX載體。

8.權利要求2中所述標簽蛋白可以為麥芽糖結合蛋白、6×組氨酸標簽等，優選6×組氨酸標簽。