[發明專利]一種提取擴增單克隆間充質干細胞的方法及所用培養液

無效

• 申請號: 201110396705.6
• 申請日: 2011-12-02
• 公開（公告）號: CN102433301A
• 公開（公告）日: 2012-05-02
• 發明（設計）人: 金宜強;楊立敏;鄭佳威
• 申請（專利權）人: 上海安集協康生物技術有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及細胞提取及培養、擴增領域，具體涉及一種無血清條件下提取擴增單克隆間充質干細胞的方法，及該方法中使用的間充質干細胞無血清培養液。

背景技術

間充質干細胞(MSC，Mesenchymal?Stem?Cell)來源于發育早期的中胚層和外胚層，因其具有多向分化潛能、造血支持和促進干細胞植入、免疫調控和自我復制等特點而日益受到人們的關注。間充質干細胞在體內或體外特定的誘導條件下，可分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、肌腱、韌帶、神經、肝、心肌、內皮等多種組織細胞，連續傳代培養和冷凍保存后仍具有多向分化潛能，可用于生命科學研究、藥物篩選測試、組織器官修復研究等多種用途。

間充質干細胞最初在骨髓中發現，隨后還發現存在于人體發生、發育過程的許多種組織中，如骨髓、脂肪、滑膜、骨骼、肌肉、肺、肝、胰腺等組織以及羊水、臍帶血、胎盤等。與其他組織來源相比，從胎盤和臍帶組織中分離出的間充質干細胞具備如下優點：①細胞更原始，有更強的增殖分化能力；②免疫細胞較為幼稚，功能活性低，不會觸發免疫反應及引起移植物抗宿主病；③潛伏性病毒和病原微生物的感染及傳播幾率比較低；④采集時對提供者無任何危害及損傷；⑤倫理學爭議少。其中與臍帶血相比，由于胎盤組織體積大，胎盤中儲藏的間充質干細胞數量更加豐富，是間充質干細胞的理想來源。

目前的間充質干細胞提取擴增的方法一般是將供體組織消化，采用密度梯度離心法、流式細胞儀分選法、貼壁培養法等一種或多種方法提取帶有特定特征(如密度1.073g/ml、貼壁生長特性、帶有特定蛋白標志物)的細胞在有血清條件下進行培養擴增，擴增到一定規模后對獲得的細胞培養物進行鑒定，絕大部分符合間充質干細胞特征即認定為間充質干細胞，然后將細胞培養物繼續有血清培養或轉入無血清培養液繼續培養，或直接使用。采用此類方法獲得的間充質干細胞是供體組織中眾多細胞培養擴增產生的后代，不免摻雜有許多性狀類似的非間充質干細胞，細胞純度一般只有70％左右；并且由于血清質量的不穩定性，可能會影響到細胞質量的穩定性。

為了提高間充質干細胞制品的純度，我們發明了一種無血清條件下提取擴增單克隆間充質干細胞的方法及所用培養液，并對接種密度、挑選單克隆細胞群落的條件、鑒定時機、培養液成分等條件進行了優化。通過該方法能夠在8周的時間內無血清條件下完成單克隆間充質干細胞的篩選、規模化擴增和鑒定，挑選的單克隆細胞的鑒定符合率在85％以上，最終獲得的單克隆間充質干細胞制品純度可達95％以上，制品中的細胞是原始組織中單個細胞的后代，性狀高度均一，從而使間充質干細胞制品使用效果更顯著、產品質量更穩定，并減少血清、雜質細胞對研究結果、受試動物或受試人體可能產生的額外影響。該方法不需要使用價格極其昂貴的流式細胞儀和抗體進行分選，因而還具有投入低、易推廣的優點。

發明內容

為了克服現有技術提取擴增間充質干細胞存在的細胞純度低的問題，本發明提供了一種提取擴增單克隆間充質干細胞的方法及所用培養液，通過該方法能夠在8周內無血清條件下完成單克隆間充質干細胞的篩選、規模化擴增和鑒定，獲得的細胞是原始組織中單個細胞的后代，性狀高度均一，細胞純度可達95％以上。

本發明的技術方案依次包括以下步驟：

(1)單個核細胞接種：

從供體組織中分離出單個核細胞，根據培養容器的底部表面積，以0.5～5×10^6細胞/cm²的密度接種于間充質干細胞無血清培養液，進行培養，培養期間每隔2-3天更換一次新鮮無血清培養液；

(2)挑選單克隆：

培養至接種后3周，選取貼壁生長的由100-150個梭形細胞組成的旋渦狀單克隆細胞群落(圖1)，將其挑下并接種于含有無血清培養液的培養容器中，進行培養，培養期間每隔2-3天更換一次新鮮無血清培養液，細胞長滿瓶壁后消化傳代；

(3)細胞鑒定：

當一個單克隆培養的細胞總數達5×10^6個細胞以上時，鑒定其是否符合間充質干細胞特征，不符合的廢棄，符合的繼續培養擴增或用于其他用途；

通過以上步驟最終獲得高純度的單克隆間充質干細胞。

在一個實施方案中，所述的供體組織是胎盤小葉。