[發明專利]一種重組型核酸建構物及使用重組型核酸建構物快速回收胺基酸組成物的方法

有效

• 申請號: 201110395072.7
• 申請日: 2011-12-02
• 公開（公告）號: CN103031326A
• 公開（公告）日: 2013-04-10
• 發明（設計）人: 趙云鵬;張智翔;姜中人
• 申請（專利權）人: 逢甲大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12R1/19
• 代理公司: 北京中博世達專利商標代理有限公司 11274
• 代理人: 申健;王俊民

技術領域

本發明是關于一種重組型核酸建構物及使用重組型核酸建構物快速回收胺基酸組成物的方法，尤其關于一種在大腸桿菌生產重組蛋白質的工業化制程中，自培養基快速回收大腸桿菌所釋出的蛋白質的方法。?

背景技術

人類基因體計劃(Human?genome?project)的終極目標在于勾畫出生命的基本藍圖，以便人類能藉此得以了解生理機能及窺探生命奧妙的所在；另一方面，科學家也可藉此按圖索驥以破解人類基因之謎，并運用生物關鍵技術來解決人類遺傳疾病的問題，以及發展促進人類未來福祉等相關生物技術。由于這個堪稱為二十一世紀人類最偉大計劃的順利推展，也推動了許多真核和原核生物細胞基因體計劃的熱潮，可預期的是，未來我們將更了解許多基因的基本功用和追溯出相仿蛋白質家族間的演化歷程及相關性，以及更進一步了解蛋白質體之間的相互作用對于一個細胞基本生命運作的意義。尤為重要的是，許多具有特殊功用的蛋白質亦將陸續被發現和被運用來增進人類的福祉，而重組基因技術將在此刻扮演最關鍵的角色。這項技術影響范圍將涉及化學工業、生技醫藥工業、農牧漁業、能源、環境凈化等領域，例如重組基因技術可將我們有興趣的目標基因(target?gene)選殖至一個適當的載體(vector)上，隨后將所形成的重組型載體輸送至一勝任的宿主細胞(competent?host?cell)中，由此所形成的重組型宿主細胞可于一適當的培養基與培養條件下進行培養，并于適當時機誘導該目標基因的表現，以大量合成所需的重組型蛋白質，這些重組型蛋白質可包括工農業用酵素、木質纖維素水解酶、治療性蛋白質(therapeutic?proteins)、干擾素(interferons)、間白素(interleukins)、激素(hormones)、生長激素(growth?hormones)、抗原性多肽?(antigenic?polypeptides)、抗體(antibodies)等各類產品。?

利用細菌細胞如大腸桿菌作為宿主細胞來生產重組蛋白質，目前仍是最具有經濟、簡單、方便等競爭條件，其原因在于大腸桿菌易于培養且生長速率快，?而所需營養基質較經濟、簡單，并且容易將培養體積放大，菌株對于酸酵的環境條件變化較不敏感，尤其可于細胞內大量累積生產重組蛋白質。然而大腸桿菌缺乏將蛋白質外泌到細胞外的能力，因此為了純化于胞內累積生產的重組型蛋白質時，工業傳統的方法就必須使用破菌的機械設備，將胞內釋放出來。?

藉由大腸桿菌生產重組型蛋白質的工業化下游純化程序，主要包括(1)菌株離心回收，(2)回收菌株破裂，(3)菌液分離，(4)蛋白質純化，(5)包裝等；傳統的制程，使用工業級連續式離心機將發酵后的菌株離心回收，并利用工業級的均質機予以打破，以便將于細胞內生產的蛋白質釋出。然而工業級連續式離心機價格昂貴，處理時間冗長，且菌株回收效率有限；此外，工業級的均質機破菌效果相當有限，也耗費時日。?

為了便于回收于大腸桿菌胞內生產的重組型蛋白質，Morita等人采用嗜菌體T4溶菌基因Gpt和嗜菌體T7溶酶素來破裂大腸桿菌(Biotechnol.Prog.，2001，17：573-576)。溶菌基因Gpt是一種已知可作用于細胞膜的蛋白質holin，而嗜菌體T7溶酶素具有可分解細胞壁的功能。Morita等人將Gpt和T7溶酶素基因選殖(clone)在一個載體上，并使用T7基因表現系統，以T7啟動子來調控此兩個基因的表現。以生產重組型β-glucuronidase(GUS)為例，實驗結果顯示，當使用1mM?isopropyl-β-D-galactoside(IPTG)的誘導劑來強制表現Gpt和T7溶酶素，可有效達到細胞溶菌的效果，并能將重組型GUS釋放于胞外。然而，以IPTG為誘導物難以達到工業化使用的目的，其主要原因為(1)IPTG的價格昂貴；(2)IPTG不被細菌代謝，易污染發酵液，而增加發酵產品純化的困難度；(3)IPTG具有潛在的毒性，不適用于生產醫療用的產品；(4)為了達到均勻誘發細胞群的基因表現，需要使用高飽和劑量的IPTG。此外，T7基因表現是目前大腸桿菌中最強的基因表現系統，用來生產重組蛋白質最為有效。然而，該研究使用T7基因表現系統來控制Gpt和T7溶酶素的表現，此策略將使得目標蛋白無法使用T7基因表現系統來表現所欲生產的標的蛋白質，因此限制目標蛋白的生產效能；另一方面，Morita等人的研究報告中并未明述其標的蛋白質(GUS)釋放出胞外的效率，以致難以評估其技術的效能。?