[發(fā)明專(zhuān)利]具有降解氨基甲酸乙酯功能的膠紅酵母及其在酒類(lèi)及食品中的應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110395044.5
• 申請(qǐng)日: 2011-12-02
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102492633A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-06-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 徐巖;吳群
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N1/16
• 分類(lèi)號(hào): C12N1/16;C12N1/02;C12H1/15;A23L1/015;C12R1/645
• 代理公司: 無(wú)錫市大為專(zhuān)利商標(biāo)事務(wù)所 32104
• 代理人: 時(shí)旭丹;劉品超

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一株能夠降解氨基甲酸乙酯的膠紅酵母，以及一種通過(guò)酶法降解酒類(lèi)及食品中氨基甲酸乙酯，以提高食品安全性的方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

氨基甲酸乙酯(Ethyl?carbamate，簡(jiǎn)稱(chēng)EC，又稱(chēng)Urethane)，是煙草葉及香煙的天然成分，也是發(fā)酵食品(如面包，酸奶，乳酪等)和酒精飲品(如葡萄酒、白蘭地、威士忌、果酒、中國(guó)黃酒和日本清酒等)的伴隨產(chǎn)物。它能夠?qū)е路文[瘤、淋巴癌、肝癌、皮膚癌等。自2002年以來(lái)，EC已經(jīng)成為世界衛(wèi)生組織重點(diǎn)監(jiān)控物質(zhì)之一。人類(lèi)從膳食中攝入的氨基甲酸乙酯，主要來(lái)自發(fā)酵食品和飲品，其中酒精飲品是已知的氨基甲酸乙酯主要來(lái)源。根據(jù)公布的2005年2月在意大利羅馬召開(kāi)的JECFA(聯(lián)合食品添加劑專(zhuān)家委員會(huì))第64次會(huì)議對(duì)EC的MOE(暴露最大限量，Margin?of?Exposure)討論的結(jié)論認(rèn)為，加上酒精飲品后的EC食品總攝入量存在風(fēng)險(xiǎn)，因此應(yīng)該繼續(xù)進(jìn)行降低酒類(lèi)食品中EC含量的努力。2007年4月10日，世界衛(wèi)生組織的國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)正式將氨基甲酸乙酯歸為2A類(lèi)致癌物，與丙烯酰胺同等危險(xiǎn)，美國(guó)國(guó)家毒理計(jì)劃將其列入“有理由預(yù)料引起癌癥的物質(zhì)”名單。因此如何降低酒精飲品中EC的含量正逐漸受到研究人員的重視。

對(duì)EC的研究始于20世紀(jì)中期，1943年，Nattleship等人就證明其潛在的致癌作用，1971年，Lofroth和Gcjval在發(fā)酵食品中發(fā)現(xiàn)了EC，1976年，Ough發(fā)現(xiàn)酒精飲品中含有EC。由于EC的致癌作用，世界衛(wèi)生組織對(duì)軟飲料中EC制定了限量標(biāo)準(zhǔn)。1985年，加拿大報(bào)道了某些酒中EC含量高，同年加拿大政府的衛(wèi)生與福利組織規(guī)定了各類(lèi)酒中的EC限量標(biāo)準(zhǔn)：佐餐葡萄酒30μg/L，強(qiáng)化葡萄酒100μg/L，蒸餾酒150μg/L，烈性酒、水果白蘭地400μg/L，日本清酒100μg/L。美國(guó)的葡萄酒工業(yè)也對(duì)葡萄酒中EC含量做出了限定：佐餐葡萄酒15μg/L，餐后甜葡萄酒60μg/L。

國(guó)內(nèi)外很多研究學(xué)者對(duì)葡萄酒和黃酒等酒精飲品的生產(chǎn)過(guò)程中EC的形成做了很多研究報(bào)道，主要的形成途徑有4類(lèi)：焦碳酸二乙酯同氨反應(yīng)形成氨基甲酸乙酯；氨基甲酸磷酸同乙醇反應(yīng)；尿素同乙醇反應(yīng)；瓜氨酸與乙醇反應(yīng)。其中尿素與乙醇的反應(yīng)被認(rèn)為是EC的主要形成途徑。

目前對(duì)于酒精飲品中EC含量控制問(wèn)題的研究，主要集中于酸性脲酶的使用以及低產(chǎn)尿素釀酒酵母的選育，旨在通過(guò)前體尿素的降低來(lái)達(dá)到控制EC含量的目的。中國(guó)新型黃酒工藝也積極通過(guò)煎酒溫度與時(shí)間的控制來(lái)控制EC。然而，這些都不能從根本上解決釀造酒中EC的污染問(wèn)題，EC一經(jīng)形成，就極穩(wěn)定，不能被脲酶降解，所以對(duì)于已經(jīng)形成的EC，目前的方法就顯得束手無(wú)策。因此利用微生物酶法降解EC的研究迫在眉睫，開(kāi)發(fā)微生物合成的EC降解酶，實(shí)現(xiàn)其有效應(yīng)用，對(duì)于提高釀造食品安全性具有重要的作用。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)難點(diǎn)及存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一株能夠用于酒類(lèi)及發(fā)酵食品中EC去除的膠紅酵母菌株。本發(fā)明所述的菌株能夠通過(guò)微生物酶的生物催化作用，在乙醇濃度0～20%，糖濃度0～400g/L，及pH?3.5-11.0的環(huán)境中以分解EC的方式達(dá)到提高酒類(lèi)及食品安全性的目的。

本發(fā)明的技術(shù)方案：一株降解EC的酵母菌株，其分類(lèi)命名為膠紅酵母(Rhodotorula?mucilaginosa)，已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC?No：5081。

所述的膠紅酵母，其具體篩選步驟如下：(1).將一定量待分離樣品中國(guó)白酒大曲、黃酒麥曲及小鼠糞便于裝有玻璃珠的適量無(wú)菌生理鹽水中震蕩打散，取一定量接種于50mL以EC為唯一碳源的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中富集，進(jìn)行搖床震蕩培養(yǎng)，溫度30℃，轉(zhuǎn)速150r·min^-1；當(dāng)菌液變得渾濁時(shí)，進(jìn)行下一次轉(zhuǎn)接，經(jīng)過(guò)連續(xù)馴化培養(yǎng)，最終得到能以EC為唯一碳源的穩(wěn)定菌液。(2).將(1)中所得菌液在以EC為唯一碳源，另外添加指示劑的固體培養(yǎng)基上進(jìn)行稀釋涂布，挑取能形成變色圈的單菌落作為初篩菌株。(3).將上述初篩菌株進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵，采用GC-FID方法檢測(cè)EC降解情況，考察、比較各菌的降解效果，選取EC濃度較低的菌株作為復(fù)篩菌株。(4).將上述復(fù)篩菌株接種于改進(jìn)的YPD培養(yǎng)基中，30℃搖床震蕩培養(yǎng)72h，取一定量發(fā)酵液離心收集菌體，經(jīng)生理鹽水與緩沖液充分洗滌，進(jìn)行酶活測(cè)定。最終得到一株能夠高效降解EC的膠紅酵母菌株。