[發(fā)明專利]一種用于新生兒葡萄糖六磷酸脫氫酶缺乏癥篩查的試劑盒及其制備方法

有效

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• 申請日: 2011-12-02
• 公開（公告）號: CN102519925A
• 公開（公告）日: 2012-06-27
• 發(fā)明（設計）人: 吳道貧;馮健明;汪勤;沈健;何海榮;孫勇;趙可輝;王云愛
• 申請（專利權）人: 廣州市豐華生物工程有限公司
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;G01N33/52
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 陳衛(wèi)

技術領域

本發(fā)明涉及檢測試劑盒領域，具體涉及一種用于新生兒葡萄糖六磷酸脫氫酶缺乏癥篩查的試劑盒及其制備方法。

背景技術

葡萄糖六磷酸脫氫酶缺乏癥為紅細胞葡萄糖六磷酸脫氫酶（G6PD）顯著缺乏所導致的一組異質性疾病，俗稱“蠶豆病”，是一種最常見的遺傳性酶缺陷病。葡萄糖六磷酸脫氫酶缺乏癥（Glucose-6-phosphate?dehydrogenase?G6PD）是幾乎所有高、低等生物重要看家酶之一，分子量為59kDa，其活性形式由2個或4個亞單位組成，每個亞單位含515個氨基酸。該酶催化細胞能量代謝過程磷酸己糖旁路途徑的限速步驟，并在此過程中把NADP（輔酶Ⅱ）還原為NADPH，后者為還原型谷胱甘肽合成所必需，是紅細胞抗氧化反應中的重要因子。

G6PD酶活性的缺乏直接影響到紅細胞的抗氧化能力，可導致溶血性貧血、蠶豆病、新生兒高膽血紅素血癥等病患，是人類最常見的酶缺陷病，全球范圍內約累及4億人。目前已發(fā)現(xiàn)400多種G6PD變異株，由150多種G6PD基因的突變引起，突變的類型和頻率呈現(xiàn)明顯的地域或群體特異性。此病主要見于非洲、地中海沿岸、中東、亞洲、太平洋諸島、南美洲等瘧疾曾一度流行的熱帶和亞熱帶地區(qū)，普遍認為與瘧疾的抗性選擇有關，但一直缺乏足夠和必要的直接證據(jù)。我國是本病的高發(fā)區(qū)之一，呈南高北低的分布特點，患病率為0.2-44.8%。主要分布在長江以南各省，以海南、廣東、廣西、云南、貴州、四川等省為高。G6PD缺乏癥發(fā)病原因是由于G6PD基因突變，導致該酶活性降低，紅細胞不能抵抗氧化損傷而遭受破壞，引起溶血性貧血。

G6PD缺乏癥的臨床表現(xiàn)與一般溶血性貧血大致相同。分新生兒黃疸、蠶豆病、藥物性溶血、感染性溶血、非球形細胞溶血性貧血等臨床類型。本病臨床表現(xiàn)的輕重程度不同，多數(shù)患者，特別是女性雜合子，平時不發(fā)病，無自覺癥狀，部分患者可表現(xiàn)為慢性溶血性貧血癥狀。常因食用蠶豆、服用或接觸某些藥物、感染等誘發(fā)血紅蛋白尿、黃疸、貧血等急性溶血反應。因G6PD缺乏誘發(fā)的嚴重的急性溶血性貧血因紅細胞破壞過多，如不及時處理，可引起肝、腎、或心功能衰竭，甚至死亡。60年代在廣東興寧地區(qū)在蠶豆收獲季節(jié)曾爆發(fā)G6PD缺乏癥的流行，導致許多患者的死亡。G6PD缺乏癥又是新生兒病理性黃疸的主要原因。據(jù)中山醫(yī)大的一項統(tǒng)計表明，患G6PD缺乏癥的新生兒中，約50%的患兒會出現(xiàn)新生兒黃疸，其中約12%可發(fā)展為核黃疸，導致腦部損害，引起智力低下。

G6PD缺乏癥在無誘因不發(fā)病時，與正常人一樣，無需特殊處理。防治的關鍵在于預防，嚴格遵照健康處方，預防發(fā)作。其次是對妊娠晚期孕婦或新生兒服用小劑量苯巴比妥，可有效減低新生兒核黃疸的發(fā)生。輸血是本病急性發(fā)作時最有效的療法，其次是糾正酸中毒、處理腎衰。輕中度溶血患者一般用補液治療。

目前，國際上WHO推薦的6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶(G6PD/6PGD)直接比值法(UVST)是臨床實驗室確診G6PD缺乏癥的最佳方法。而我國新生兒G6PD缺乏癥篩查的普遍使用為熒光斑點和熒光分析法，其中最常用的方法為熒光分析法，該法原理為G-6-P底物在G6PD催化下轉變6PG，同時伴隨發(fā)生NADPH（可發(fā)熒光）增加，通過檢測NADPH的量來測定葡萄糖6磷酸脫氫酶活性。篩查血斑標本與底物試劑G6P和NADP在室溫混合30min可發(fā)生上述反應，加入銅溶液使反應終止，用熒光儀在波長355nm激發(fā)光和波長460nm發(fā)射光下測定反應物熒光。通過標準曲線得出未知樣本和質控品中G6PD濃度（U/gHb），G6PD活性低于正常值者為G6PD缺乏。但是熒光分析法對于貧血，溶血，凝血及陳舊的血樣標本假陽性率高，準確率低。

現(xiàn)有G6PD／6PGD比值法技術在檢測葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥，主要應用于生化儀或者手工測定全血樣本中壓積紅細胞的G6PD和6PGD活性之定量比值。如廣州米基公司生產(chǎn)的改良葡萄糖-6-磷酸脫氫酶測定試劑盒（定量比值法）其原理是：G6PD催化試劑中的葡萄糖六磷酸（6PG）生成六磷酸葡萄糖酸（6PG），伴有還原型輔酶II（NADPH）的生成，NADPH的H在PMS的遞氫作用下，將氧化型的NBT（黃色）轉變?yōu)檫€原型NBT（藍色）。藍色的深淺與NADPH的生成量成正比關系，用分光光度計650nm比色（S1）。作為G6PD的同功酶6PGD，也有將氧化型輔酶II（NADP+）轉化成NADPH的作用，同法測得NADPH的量（S2），通過S1/S2的比值得出NADPH的相對含量。