[發(fā)明專利]一種烏鱧腹水病疫苗的制備方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110393783.0
• 申請日: 2011-12-01
• 公開（公告）號: CN102552894A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發(fā)明（設計）人: 李進村;吳多生;馮毅;章曉紅;沙正月
• 申請（專利權(quán)）人: 李進村
• 主分類號: A61K39/02
• 分類號: A61K39/02;A61P31/04
• 代理公司: 安徽合肥華信知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 34112
• 代理人: 方崢

技術領域

本發(fā)明涉及水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治領域，具體涉及一種烏鱧腹水病疫苗的制備方法。

背景技術

烏鱧屬鱸形目、鱧科，俗稱烏魚、才魚、黑魚等，是以魚類為食的經(jīng)濟價值和營養(yǎng)價值較高的淡水名貴魚類。烏鱧骨刺少，含肉率高，而且營養(yǎng)豐富，據(jù)測定，每100g烏鱧肉含蛋白質(zhì)19.8g，脂肪1.49g，碳水化合物1.2g，并富含人體所需的鈣、磷、鐵、鋅等營養(yǎng)元素。烏鱧還具有祛濕治病，祛痰生新，通氣消腫，活血滋補，生肌補血等藥用功效。因此，烏鱧歷來深受東南亞各國和港、澳市場的歡迎，是我國外貿(mào)出口的重要水產(chǎn)品之一。當前隨著烏鱧養(yǎng)殖規(guī)模的擴大，集約化養(yǎng)殖程度的提高，其病害的危害也越來越大，其危害程度有加劇趨勢，其常見病有：水霉病、腐皮病、爛鰓病、腹水病、出血病、小瓜蟲病、紅線蟲病等，特別是烏鱧腹水病(Ascitesosis?of?China?snakehead)傳染性強，發(fā)病率高、死亡率最高，可造成魚種、成魚大量死亡，給養(yǎng)殖戶造成較大經(jīng)濟損失。其病原體是費氏枸緣酸桿菌(Gitrobacter?freundii)，是該菌廣泛分布于自然界，是人和動物腸道的正常菌落，是機會致病菌，皮膚和腸道是腹水病病原菌的侵入門戶。當皮膚受傷可使病原菌侵入機體而發(fā)病。引起外傷的主要原因有網(wǎng)撈損傷和寄生蟲寄生損傷等。另外，由于投喂變質(zhì)餌料，烏鱧攝食后，導致腸道內(nèi)正常菌落失調(diào)，為病原菌入侵創(chuàng)造了機會。

近幾年來，國產(chǎn)、進口的藥物對烏鱧腹水病均無明顯療效或成本太高，效果不明顯。只能通過免疫的途徑進行預防，而這種疫苗目前在還是空白。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種烏鱧腹水病疫苗的制備方法，本發(fā)明成本低廉，操作方便，可有效提高烏鱧免疫力，防治烏鱧腹水疾病發(fā)生。

本發(fā)明是通過下面的技術方案來實現(xiàn)的。

一種烏鱧腹水病疫苗的制備方法，其特征在于，具體步驟如下：

(1)、提取菌種：從患有明顯腹水病癥狀的烏鱧肝臟、腎臟、血液、腹水中分離出病原菌費氏枸緣酸桿菌，立即放入4-8℃的冰箱中保存；

(2)、感染：將分離的病原菌接種于健康的烏鱧體內(nèi)，在室內(nèi)進行感染試驗，每只烏鱧接種的病原菌數(shù)為1×10⁹-2×10⁹個，檢查是否有毒力，證明確有毒力才用作制疫苗材料；將分離的病原菌倒入滅菌空試管中，用無菌生理鹽水稀釋調(diào)節(jié)菌濃度，與麥氏比濁管進行比色，使菌濃度達到5×10⁹cfu/ml；

(3)、取材：取上述烏鱧發(fā)病組織材料，稱重，每克組織材料中加0.85％生理鹽水9-11毫升10，用研缽或勻漿器進行勻漿，制成9％-10％濃度的組織懸液，將制得的組織懸液直接置于-30℃～-40℃低溫冰箱中保存，或者向制得的組織懸液中按10％加入50％的磷酸緩沖甘油，將其置4-8℃的冰箱中保存。

(4)、懸液制備：將步驟(3)分離出的致病菌費氏枸緣酸桿菌接種在普通瓊脂營養(yǎng)基或肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)24-48小時，加入少量生理鹽水，用接種環(huán)將菌苔刮下，充分振蕩，制成細菌分布均勻的懸液；

(5)、擴大培養(yǎng)：取單個菌落在25-30℃條件下培養(yǎng)48-72小時，振蕩使培養(yǎng)斜面上的菌落洗下，或用滅菌接種環(huán)輕輕刮下，進行滅活處理；

(6)、滅活：將擴大培養(yǎng)結(jié)束的費氏枸緣酸桿菌懸液搖勻，放入60-70℃恒溫水浴1.5-2.5小時滅活或32℃恒溫水浴中70-73小時滅活，即制成滅活疫苗；

(7)、合成：將滅活后的菌液置于高速離心機中，用3000轉(zhuǎn)/分離心機離心30-40分鐘，分離出上清液，向分離出的上清液中添加一定量得青霉素、鏈霉素和濃度為10％的福爾馬林溶液，并搖勻，其中，每10毫升上清液中加入青霉素7500-8500單位、鏈霉素7500-8500單位，10％濃度的福爾馬林溶液0.1-0.12毫升；

(8)、稀釋：用0.85％的無菌鹽水稀釋至滅活菌液濃度為5×10⁹cfu/ml；

(9)、分裝：將稀釋后的滅活菌液，置于4-8℃冰箱中保存?zhèn)溆茫?/p>

(10)、檢驗：對上述稀釋好的滅活菌液進行無菌、安全及免疫效果三項檢驗，要求，滅活菌液中沒有活菌存在，滅活細菌的安全的系數(shù)要達到100％，免疫保護率達到80％以上；

(11)、檢驗合格后的滅活菌液，繼續(xù)置于4-8℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?!-- SIPO -->

步驟(7)合成時，每10毫升上清液中加入青霉素8000單位、鏈霉素8000單位，10％濃度的福爾馬林溶液0.1毫升。