[發明專利]一種烏鱧腹水病疫苗的制備方法

無效

• 申請號: 201110393783.0
• 申請日: 2011-12-01
• 公開（公告）號: CN102552894A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: 李進村;吳多生;馮毅;章曉紅;沙正月
• 申請（專利權）人: 李進村
• 主分類號: A61K39/02
• 分類號: A61K39/02;A61P31/04
• 代理公司: 安徽合肥華信知識產權代理有限公司 34112
• 代理人: 方崢

1.一種烏鱧腹水病疫苗的制備方法，其特征在于，具體步驟如下：

(1)、提取菌種：從患有明顯腹水病癥狀的烏鱧肝臟、腎臟、血液、腹水中分離出病原菌費氏枸緣酸桿菌，立即放入4-8℃的冰箱中保存；

(2)、感染：將分離的病原菌接種于健康的烏鱧體內，在室內進行感染試驗，每只烏鱧接種的病原菌數為1×10⁹-2×10⁹個?，檢查是否有毒力，證明確有毒力才用作制疫苗材料；將分離的病原菌倒入滅菌空試管中，用無菌生理鹽水稀釋調節菌濃度，與麥氏比濁管進行比色，使菌濃度達到5×10⁹cfu/ml；

(3)、取材：取上述烏鱧發病組織材料，稱重，每克組織材料中加0.85%生理鹽水9-11毫升10，用研缽或勻漿器進行勻漿，制成9%-10%濃度的組織懸液，將制得的組織懸液直接置于-30℃～-40℃低溫冰箱中保存，或者向制得的組織懸液中按10%加入50%的磷酸緩沖甘油，將其置4-8℃的冰箱中保存；

(4)、懸液制備：將步驟（3）分離出的致病菌費氏枸緣酸桿菌接種在普通瓊脂營養基或肉湯培養基內，培養24-48小時，加入少量生理鹽水，用接種環將菌苔刮下，充分振蕩，制成細菌分布均勻的懸液；

(5)、擴大培養：取單個菌落在25-30℃條件下培養48-72小時，振蕩使培養斜面上的菌落洗下，或用滅菌接種環輕輕刮下，進行滅活處理；

(6)、滅活：將擴大培養結束的費氏枸緣酸桿菌懸液搖勻，?放入60-70℃恒溫水浴1.5-2.5小時滅活或32℃恒溫水浴中70-73小時滅活，即制成滅活疫苗；

(7)、合成：將滅活后的菌液置于高速離心機中，用3000轉/分離心機離心30-40分鐘，分離出上清液，向分離出的上清液中添加一定量得青霉素、鏈霉素和濃度為10％?的福爾馬林溶液，并搖勻，其中，每10毫升上清液中加入青霉素?7500-8500單位?、鏈霉素7500-8500單位，?10％濃度的福爾馬林溶液0.1-0.12毫升；

（8）、稀釋：用0.85％的無菌鹽水稀釋滅活菌液至濃度為5×10⁹cfu/ml?；?

（9）、分裝：將稀釋后的滅活菌液，置于4-8℃冰箱中保存備用；

（10）、檢驗：對上述稀釋好的滅活菌液進行無菌、安全及免疫效果三項檢驗，要求，滅活菌液中沒有活菌存在，滅活細菌的安全的系數要達到100%，免疫保護率達到80%以上；

（11）、檢驗合格后的滅活菌液，繼續置于4-8℃冰箱中保存備用。

2.根據權利要求1所述的烏鱧腹水病疫苗的制備方法，其特征在于：步驟（7）合成時，每10毫升上清液中加入青霉素?8000單位、鏈霉素8000單位，10％濃度的福爾馬林溶液0.1毫升。

3.根據權利要求1所述的烏鱧腹水病疫苗的制備方法，其特征在于：步驟（10）所述的無菌檢驗方法具體操作是：提取?0.2ml?滅活菌樣本接種在普通營養瓊脂培養基上，在25-28℃條件下培養48小時，觀察是否形成菌落，若形成菌落則說明疫苗含菌，必須重新滅活，只有在瓊脂平板上沒有出現菌落出現才說明滅活徹底，滅活菌液中確實沒有活菌存在。

4.根據權利要求1所述的烏鱧腹水病疫苗的制備方法，其特征在于：步驟（10）所述的安全檢驗方法具體操作是：對當年健康烏鱧魚種進行腹腔注射，每尾注射0.3-0.5毫升，在水溫25-28℃的水缸中飼養，經?15d?觀察無發病或死亡說明該滅活細菌是安全的，必須做到100%安全才可使用。

5.根據權利要求1所述的烏鱧腹水病疫苗的制備方法，其特征在于：步驟（10）所述的免疫效果檢驗方法具體操作是：在給健康烏鱧接種上述制備的疫苗，二周后進行攻毒，觀察免疫保護率，具體操作方法是取上述疫苗，每尾烏鱧注射疫苗量為?0.5?ml?，每天觀察烏鱧的發病及癥狀等情況并做好記錄，另外用新鮮的或甘油保存的病魚組織制成的未經滅活處理的濃度為10%的懸液，分別注射到已注射過疫苗的烏鱧和沒有注射過疫苗的烏鱧體內進行對照，每尾按0.3-0.5毫升進行腹腔注射，繼續觀察15天，如果對照組全部發生腹水病，死亡率在70％以上，病烏鱧癥狀與天然發病的癥狀一樣或相似，而免疫組仍健康存活，免疫保護率在80%以上，證明此疫苗有效。