[發(fā)明專利]一種利用Vero傳代細(xì)胞制備禽流感病毒及其滅活疫苗的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110393316.8
• 申請(qǐng)日: 2011-12-01
• 公開（公告）號(hào): CN102586195A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 丁國(guó)杰;張楊;付麗杰;李東偉;焦利紅;吳金
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司
• 主分類號(hào): C12N7/00
• 分類號(hào): C12N7/00;A61K39/145;A61P31/16
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11139
• 代理人: 孫皓晨;費(fèi)碧華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種滅活疫苗的制備方法，特別涉及一種利用VERO傳代細(xì)胞制備禽流感病毒滅活疫苗的方法。本發(fā)明屬于畜牧獸醫(yī)技術(shù)領(lǐng)域。?

背景技術(shù)

禽流感是目前危害世界養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展的重要疾病，特別是高致病性禽流感的暴發(fā)，給養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)了毀滅性的災(zāi)難。2004年至今，中國(guó)內(nèi)地相繼暴發(fā)高致病性禽流感，不僅沉重打擊了國(guó)內(nèi)的養(yǎng)禽業(yè)，而且對(duì)我國(guó)的經(jīng)濟(jì)和貿(mào)易發(fā)展也造成了嚴(yán)重的影響。?

自1933年雞胚培養(yǎng)流感病毒獲得成功以來(lái)，雞胚就成了人們大量獲得流感病毒的主要來(lái)源。但用雞胚分離流感病毒或傳代易引起病毒變異，而且雞胚殘留物還可引起過敏性反應(yīng)。雞胚作為疫苗生產(chǎn)基質(zhì)，還存在大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)供給和潛在外源病毒污染問題。近幾年，隨著禽流感的頻繁暴發(fā)以及跨種屬傳播，需要一種可在流感大流行時(shí)能夠替代雞胚快速、大量生產(chǎn)流感病毒的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。本研究應(yīng)用Vero細(xì)胞系培養(yǎng)流感病毒解決了雞胚蛋白遺留物和外源病毒污染的問題，且培養(yǎng)的病毒免疫原性更穩(wěn)定。?

流感病毒只有當(dāng)其血凝素(HA)為裂解狀態(tài)時(shí)其病毒顆粒才具感染性，HA能否被蛋白酶裂解為HA1和HA2是病毒感染細(xì)胞的先決條件。但流感病毒本身不具有裂解HA的蛋白酶，而由宿主細(xì)胞的蛋白酶作用下裂解HA，由于VERO細(xì)胞不具有HA的蛋白酶所以對(duì)HA不具有裂解能力。維持液中添加適量的胰酶，能補(bǔ)充細(xì)胞中蛋白酶的不足，增加了HA的裂解量，增強(qiáng)了流感病毒感染力，流感病毒在傳代細(xì)胞系中的復(fù)制可因培養(yǎng)液中的胰蛋白酶的快速失活而受到影響，同時(shí)胰蛋白酶抑制劑的積累也是影響胰蛋白酶活性的另一個(gè)原因。為了避免胰蛋白酶在維持液中被抑制劑作用后失活而影響HA的裂解，本研究室采用殼聚糖對(duì)胰酶進(jìn)行包被后，加入到細(xì)胞維持液中，使胰酶在維持液中緩慢釋放，克服了在病毒繁殖過程中由于胰酶的失活而影響血凝素的裂解。也避免了多次加入胰酶而對(duì)細(xì)胞造成污染的幾率。培養(yǎng)出的?病毒滴度高，穩(wěn)定性好，適合進(jìn)行大量的疫苗生產(chǎn)。禽流感傳代細(xì)胞疫苗的研制將為我國(guó)禽流感細(xì)胞型疫苗生產(chǎn)提供新的思路，該疫苗株以細(xì)胞為載體，除了在增殖速度和產(chǎn)量上都優(yōu)于目前雞胚培養(yǎng)型禽流感疫苗株外，在生產(chǎn)疫苗的價(jià)格上也有巨大的市場(chǎng)優(yōu)勢(shì)。除此之外，利用雞胚生產(chǎn)流感疫苗，在處理使用后的雞胚殘?bào)w上只能采用焚燒的辦法，既增加成本，又污染環(huán)境，而利用細(xì)胞生產(chǎn)疫苗則擺脫了對(duì)雞胚依賴，沒有處理雞胚殘?bào)w這一環(huán)節(jié)。可以說(shuō)利用傳代細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)禽流感疫苗既經(jīng)濟(jì)又環(huán)保。本試驗(yàn)的結(jié)果證明，流感病毒可在VERO細(xì)胞中快速繁殖，具備生產(chǎn)流感疫苗的潛力。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種利用Vero傳代細(xì)胞生產(chǎn)禽流感病毒及其滅活疫苗的方法。?

本發(fā)明的一種利用Vero傳代細(xì)胞生產(chǎn)禽流感病毒液的方法，其特征在于首先采用殼聚糖對(duì)胰酶進(jìn)行包被，得到包埋胰酶的殼聚糖納米粒；然后將包埋胰酶的殼聚糖納米粒加入到Vero傳代細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)液中，繼而接種病毒進(jìn)行病毒培養(yǎng)，收獲病毒液，即得。?

本發(fā)明一種利用Vero傳代細(xì)胞制備禽流感病毒滅活疫苗的方法，其特征在于由以上所述的方法制備得到的病毒液按照制備滅活疫苗的常規(guī)方法制備。?

優(yōu)選的，本發(fā)明的一種利用Vero傳代細(xì)胞生產(chǎn)禽流感病毒滅活疫苗的方法，其特征在于，具體的，包括以下步驟：?

(1)制備包埋胰酶的殼聚糖納米粒；?

(2)接種：取病毒種毒，用滅菌生理鹽水稀釋10^-5～10^-7倍，待Vero傳代細(xì)胞80％長(zhǎng)成單層后，棄掉細(xì)胞培養(yǎng)液，按培養(yǎng)液體積的1/10接入稀釋后的病毒液，37℃吸附1小時(shí)，加入維持液，在維持液中加入步驟(1)中得到的包埋胰酶的殼聚糖納米粒，37℃培養(yǎng)3天，收獲病毒液；?

(3)病毒液收獲：收獲病毒液，分裝，放入-20℃冰柜中反復(fù)凍融3次，測(cè)定每個(gè)分裝容器中病毒的HA效價(jià)，HA效價(jià)低于1∶128者棄去；同時(shí)作無(wú)菌檢驗(yàn)應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)，收獲的病毒液滅活前在2～8℃保存；?

(4)病毒液滅活：將病毒液注入滅活灌，開啟滅活罐的攪拌器，準(zhǔn)確量取10％的甲醛溶液，在不斷攪拌時(shí)加入至含抗原液的滅活灌中，使其充分?jǐn)嚢杈鶆颍患兹?溶液終濃度為0.1％；將滅活罐升溫至37℃，維持滅活時(shí)間16小時(shí)，期間不停緩慢攪拌，滅活結(jié)束后，做滅活檢驗(yàn)和無(wú)菌檢驗(yàn)，滅活后的病毒液在2-8℃保存；?

(5)制備滅活疫苗：將步驟(4)中制備得到的病毒滅火液加入佐劑制備成滅活疫苗。?

作為參考，本發(fā)明具體實(shí)施例中包埋胰酶的殼聚糖納米粒按照以下方法制備得到：?