[發明專利]一種利用Vero傳代細胞制備禽流感病毒及其滅活疫苗的方法

有效

• 申請號: 201110393316.8
• 申請日: 2011-12-01
• 公開（公告）號: CN102586195A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發明（設計）人: 丁國杰;張楊;付麗杰;李東偉;焦利紅;吳金
• 申請（專利權）人: 哈藥集團生物疫苗有限公司
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;A61K39/145;A61P31/16
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司 11139
• 代理人: 孫皓晨;費碧華

1.一種利用Vero傳代細胞生產禽流感病毒液的方法，其特征在于首先采用殼聚糖對胰酶進行包被，得到包埋胰酶的殼聚糖納米粒；然后將包埋胰酶的殼聚糖納米粒加入到Vero傳代細胞的細胞培養液中，繼而接種病毒進行病毒培養，收獲病毒液，即得。

2.一種利用Vero傳代細胞制備禽流感病毒滅活疫苗的方法，其特征在于由權利要求1所述的方法制備得到的病毒液按照制備滅活疫苗的常規方法制備。

3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，具體的，包括以下步驟：

(1)制備包埋胰酶的殼聚糖納米粒；

(2)接種：取病毒種毒，用滅菌生理鹽水稀釋10^-5～10^-7倍，待Vero傳代細胞80％長成單層后，棄掉細胞培養液，按培養液體積的1/10接入稀釋后的病毒液，37℃吸附1小時，加入維持液，在維持液中加入步驟(1)中得到的包埋胰酶的殼聚糖納米粒，37℃培養3天，收獲病毒液；

(3)病毒液收獲：收獲病毒液，分裝，放入-20℃冰柜中反復凍融3次，測定每個分裝容器中病毒的HA效價，HA效價低于1∶128者棄去；同時作無菌檢驗應無菌生長，收獲的病毒液滅活前在2～8℃保存；

(4)病毒液滅活：將病毒液注入滅活灌，開啟滅活罐的攪拌器，準確量取10％的甲醛溶液，在不斷攪拌時加入至含抗原液的滅活灌中，使其充分攪拌均勻；甲醛溶液終濃度為0.1％；將滅活罐升溫至37℃，維持滅活時間16小時，期間不停緩慢攪拌，滅活結束后，做滅活檢驗和無菌檢驗，滅活后的病毒液在2-8℃保存；

(5)制備滅活疫苗：將步驟(4)中制備得到的病毒滅火液加入佐劑制備成滅活疫苗。

4.如權利要求1-3任一項所述的方法，其特征在于包埋胰酶的殼聚糖納米粒按照以下方法制備得到：

(1)稱取脫乙酰度為85％的殼聚糖，用1％的乙酸溶解，制成濃度為0.5～2mg/mL的殼聚糖溶液，過0.22μm濾器；稱取胰酶，用去離子水溶解，制成濃度為500μg/mL的胰酶溶液，過0.22μm濾器；稱取三聚磷酸鈉，用去離子水溶解，制成濃度為1.0～2.0mg/mL的三聚磷酸鈉溶液，過0.22μm濾器；

(2)取5mL殼聚糖溶液，滴加2.5～7.5mL?500μg/mL的胰酶溶液，磁力攪拌3min，獲得溶液A；

(3)溶液A在室溫、無菌條件下以900～1300r/min磁力攪拌30s，然后逐滴加入2.5mL的三聚磷酸鈉溶液，繼續磁力攪拌10～30min，獲得溶液B；

(4)將溶液B于4℃、12000r/min離心2min，取沉淀并用等體積的pH7.4的PBS洗三次，然后加入等體積的pH7.4的PBS懸浮，真空冷凍干燥24h，獲得包埋胰酶的殼聚糖納米粒。

5.如權利要求1-3任一項所述的方法，其特征在于在維持液中加入經殼聚糖包被的胰蛋白酶，使其終濃度為6μg/ml。

6.如權利要求3所述的方法，其特征在于所述的細胞培養液為含有質量分數為6％小牛血清的DMEM培養基，所述的維持液為含有質量分數為1％小牛血清的DMEM培養基。

7.如權利要求1-3任一項所述的方法，其特征在于病毒種毒為禽流感病毒Vero細胞適應株。