[發(fā)明專利]高敏感的內(nèi)切核酸酶的生產(chǎn)方法、內(nèi)切核酸酶的新制品及其用途

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110393173.0
• 申請日: 2005-07-29
• 公開（公告）號: CN102604914A
• 公開（公告）日: 2012-07-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 阿卜杜勒菲德·本達(dá)馬內(nèi);貝內(nèi)迪克特·斯圖勒保耶斯;卡利內(nèi)·特里凱斯;米歇爾·卡博什
• 申請（專利權(quán)）人: 法國植物基因組研究計(jì)劃-華萊;法國國家農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院
• 主分類號: C12N9/22
• 分類號: C12N9/22;C12Q1/68;C12Q1/34
• 代理公司: 上海市華誠律師事務(wù)所 31210
• 代理人: 傅強(qiáng)國;賈師英

本申請是申請日為2005年7月29日、申請?zhí)枮?00580031302.4(PCT/EP2005/009220)的發(fā)明專利申請的分案申請。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及鑒定和制備具有高活性和敏感性以及寬底物特異性的錯配特異的內(nèi)切核酸酶。

背景技術(shù)

上個世紀(jì)初，對通過輻射或化學(xué)品在DNA內(nèi)部誘導(dǎo)突變的可能性的發(fā)現(xiàn)已經(jīng)為理解活體內(nèi)基因功能帶來了相當(dāng)大的希望。自那時起，誘變作用和自然序列變化已經(jīng)被廣泛地用于鑒定新功能、對應(yīng)于特異功能的基因以及一個特異蛋白質(zhì)內(nèi)部的活性位點(diǎn)。

實(shí)施這個方法的一個關(guān)鍵方面，特別是在點(diǎn)突變的情況下，是對突變檢測方法的選擇，這些方法被設(shè)計(jì)為對大段的DNA進(jìn)行篩選而不減少診斷敏感性或特異性，并且同時能提供有關(guān)突變位點(diǎn)的信息。最常用的工具當(dāng)中有基于不完全配對的DNA的方法，該DNA能夠通過兩個DNA分子的變性和復(fù)性在試管內(nèi)產(chǎn)生。使用如溝結(jié)合劑等化學(xué)品或能夠在錯配位點(diǎn)上特異地剪切單鏈DNA的分子在這些異源雙鏈分子中檢測到錯配。可替代地，單鏈特異的內(nèi)切核酸酶已經(jīng)被用于在錯配位點(diǎn)剪切DNA。目前已被描述的絕大多數(shù)內(nèi)切核酸酶屬于S1/P1類核酸酶。

例如S1、P1和綠豆核酸酶等核酸酶，屬于被命名為：“S1/P1族核酸酶”或?yàn)椋骸癝1族核酸酶”的同一族，已知能用于在單鏈區(qū)域切開DNA。但是這些核酸酶所具有的酸性pH最佳值是在4.0-5.0的范圍內(nèi)。

這對于錯配檢測是不利的，因?yàn)榈蚿H值有利于DNA脫嘌呤并且使得DNA雙鏈體不穩(wěn)定，導(dǎo)致非特異的DNA降解，并且降低檢測的敏感性和特異性。

幾年前，OLEYKOWSKI等人(Nucleic?Acids?Res，26，4597-4602，1998)從不同的植物提取物中檢測到一個錯配內(nèi)切核酸酶的活性，其具有中性的pH最佳值(大約pH?8)并在錯配位點(diǎn)的3’端完成一個單鏈切開。這些作者報(bào)道了該錯配內(nèi)切核酸酶的活性與苜蓿芽、蘆筍、芹菜和西紅柿的提取物中的甘露糖基糖蛋白(mannosyl?glycoproteins)有關(guān)。芹菜中的酶，稱之為CEL?I，是通過連續(xù)的硫酸銨沉淀步驟從芹菜莖中提純，結(jié)合到一個刀豆體球蛋白A-瓊脂糖柱并且被[α]-d+-甘露糖洗提，結(jié)合到一個磷酸纖維素柱并且被線性梯度的KCl洗提，并且用尺寸排阻色譜法分級分離。因此獲得的CEL?I制品包含幾個34-39KDa的蛋白帶。

YANG等人(Biochemistry，39，3533-3541，2000)和PCT申請WO?01/62974描述了一種改進(jìn)的CEL?I提純，它是通過在提純緩沖液中使用α-甲基甘露糖苷來克服CEL?I與內(nèi)源性選擇素的聚集反應(yīng)。這些文件還披露了CEL?I?cDNA的克隆。以序列數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，CEL?I被指定為S1/P1族核酸酶的一個亞族，并且鑒定出幾個用擬南芥(Arabidopsis?thaliana)的BFN1(GenBank核苷酸(nucleotide)AY040016)、百日草屬植物的ZEN1(GenBank核苷酸AB003131)和萱草的DSA6(GenBank核苷酸AF082031)的基因進(jìn)行編碼的可能的同系物。

CEL?I內(nèi)切核酸酶活性已經(jīng)顯示出對于堿基替換的錯配以及由于插入/缺失情況引起的錯配是高度特異的，并且獨(dú)立于側(cè)翼序列環(huán)境。因此它在包括突變篩選等不同的方法中作為突變檢測試劑是很有用的。CEL?I錯配檢測系統(tǒng)是一個簡單的測定法，它需要靶序列的聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增(PCR擴(kuò)增)、變性和退火，以允許在野生型和突變體等位基因之間生成異源雙鏈體，酶的錯配剪切，以及通過凝膠電泳法的產(chǎn)品分析。因?yàn)樗趯Υ蠖蜠NA中的錯配進(jìn)行檢測時的特異性和敏感性，它比其他流行的錯配檢測系統(tǒng)有利，比如變性HPLC。