[發(fā)明專利]一種檢測長鏈非編碼RNA-HOTAIRM1的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110393024.4
• 申請日: 2011-12-01
• 公開（公告）號: CN102399889A
• 公開（公告）日: 2012-04-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張紅河;來茂德
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 杭州求是專利事務(wù)所有限公司 33200
• 代理人: 張法高;趙杭麗

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種人長鏈非編碼RNA-HOTAIRM1檢測方法。

背景技術(shù)

長鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類長度大于200核苷酸的RNA分子，不具備編碼蛋白質(zhì)的功能的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；最初被認(rèn)為是基因組轉(zhuǎn)錄的“噪音”，RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物，不具有任何生物學(xué)功能。然而哺乳動物整個基因組普遍轉(zhuǎn)錄成轉(zhuǎn)錄本，但這些轉(zhuǎn)錄本中僅有很小一部分為編碼蛋白質(zhì)的mRNA，大部分為非編碼RNA。非編碼RNA包括結(jié)構(gòu)RNA（如tRNA、rRNA和snRNA）、近年來成為研究熱點的調(diào)節(jié)RNA（microRNA和siRNA）,以及最近科學(xué)界關(guān)注的lncRNA；在這些非編碼RNA轉(zhuǎn)錄本中l(wèi)ncRNA占近80%，而且許多l(xiāng)ncRNA具有mRNA樣結(jié)構(gòu)，經(jīng)過剪切加工具有PolyA尾樣結(jié)構(gòu)，分化過程中出現(xiàn)動態(tài)表達和不同的剪切形式，呈現(xiàn)出時間特異和空間特異的表達方式，這些現(xiàn)象表明lncRNA的表達與降解在生物體內(nèi)有著精細的調(diào)控機制。因此，lncRNA作為轉(zhuǎn)錄“噪音”和副產(chǎn)物的假說應(yīng)該重新思考，lncRNA表達不僅在胚胎干細胞分化過程中特征性表達，而且在腦細胞中存在特定的亞細胞定位，同時這些lncRNA表達存在組織器官特異性。盡管僅有一小部分長鏈非編碼RNA功能被闡釋，但可以推測lncRNA通過某種機制參與了各種生物學(xué)功能，通過表觀遺傳學(xué)修飾、轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控以及剪切拼接控制細胞周期、分化和凋亡等發(fā)揮生物學(xué)作用。顯而易見，lncRNA?必定與疾病的發(fā)生發(fā)展機制密切相關(guān)，目前已經(jīng)有報道表明腫瘤中存在差異表達的lncRNA，例如乳腺癌中HOTAIR表達升高，?MALAT在肺癌和結(jié)直腸癌中過表達以及肝癌中HULC水平上升等。HOTAIRM1是最近發(fā)現(xiàn)的位于HOXA1和HOXA2基因間的長鏈非編碼RNA，可能與造血系統(tǒng)中髓系細胞的發(fā)育和分化有關(guān)，而且在胎腦中也檢測除其表達，并參與神經(jīng)分化。

發(fā)明內(nèi)容

????本發(fā)明目的是提供一種檢測長鏈非編碼RNA-HOTAIRM1的方法，是根據(jù)長鏈非編碼RNA-HOTAIRM1的基因序列以及內(nèi)參基因GAPDH的基因序列設(shè)計并合成外側(cè)引物、內(nèi)側(cè)引物和熒光探針，并利用這兩套引物和探針特異性檢測HOTAIRM1在血漿中的相對表達。

本發(fā)明采用實時熒光PCR方法檢測一種長鏈非編碼RNA-HOTAIRM1，主要包括特異性外側(cè)引物、內(nèi)側(cè)引物和熒光探針、逆轉(zhuǎn)錄試劑和熒光PCR試劑，通過以下步驟實現(xiàn)：

（1）采用RNA抽提試劑提取組織和血漿中總RNA，DNaseⅠ去除基因組DNA后采用逆轉(zhuǎn)錄試劑進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；

（2）分別以HOTAIRM1和GAPDH的外側(cè)引物按照以下PCR反應(yīng)體系配制反應(yīng)液：1×PCR?buffer、0.1μM的外側(cè)上下游引物引物、1U的DNA聚合酶、0.2mM的dNTPs，取2μL的cDNA模板，反應(yīng)體積為20μL；按照95℃變性5分鐘，95℃?30秒、55℃?30秒，72℃?30秒進行15個循環(huán)預(yù)擴增。

（3）取2.0μL預(yù)擴增產(chǎn)物加入如下PCR反應(yīng)液中：1×TaqMan?通用PCR?緩沖液，0.2μM的內(nèi)側(cè)上下游引物引物和0.1μM的熒光探針，反應(yīng)體積為10μL；按照95℃變性2分鐘，95℃?15秒、60℃?1分鐘，擴增40個循環(huán)；

（4）根據(jù)熒光曲線讀取Ct值，按照下述公式計算HOTAIRM1的相對表達量：HOTAIRM1相對表達量=2^－ΔCt（ΔCt=Ct?_HOTAIRM1－Ct_?GAPDH）。

所述特異性內(nèi)外側(cè)引物和熒光探針的序列分別如下：

HOTAIRM1外側(cè)引物：

outer-hotiarm1-F:?GCTGGAGCGAAGAAGAGCAA，

outer-hotiarm1-R：CAAACACCCACATTTCAACCC；

HOTAIRM1內(nèi)側(cè)引物：

inner-hotiarm1-F：GAACTGGCGAGAGGTCTGTTTT，

inner-hotiarm1-R：CCCCATAAATCCCTCCACATT；

HOTAIRM1熒光探針：

hotiarm1-probe:?FAM-CCTGAACCCATCAACAGCTGGGAGA-TAMRA。

GAPDH外側(cè)引物：

outer-gapdh-F：GGCGCTGAGTACGTCGTGGA,?