[發(fā)明專利]一種檢測(cè)長(zhǎng)鏈非編碼RNA-HOTAIRM1的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110393024.4
• 申請(qǐng)日: 2011-12-01
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102399889A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-04-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張紅河;來(lái)茂德
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 杭州求是專利事務(wù)所有限公司 33200
• 代理人: 張法高;趙杭麗

1.一種檢測(cè)長(zhǎng)鏈非編碼RNA-HOTAIRM1的方法，通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)：

（1）采用RNA抽提試劑提取組織和血漿中總RNA，DNaseⅠ去除基因組DNA后采用逆轉(zhuǎn)錄試劑進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；

（2）分別以HOTAIRM1和GAPDH的外側(cè)引物按照以下PCR反應(yīng)體系配制反應(yīng)液：1×PCR?buffer、0.1μM的外側(cè)上下游引物引物、1U的DNA聚合酶、0.2mM的dNTPs，取2μL的cDNA模板，反應(yīng)體積為20μL；按照95℃變性5分鐘，95℃?30秒、55℃?30秒，72℃?30秒進(jìn)行15個(gè)循環(huán)預(yù)擴(kuò)增；

（3）取2.0μL預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物加入如下PCR反應(yīng)液中：1×TaqMan?通用PCR?緩沖液，0.2μM的內(nèi)側(cè)上下游引物引物和0.1μM的熒光探針，反應(yīng)體積為10μL，按照95℃變性2分鐘，95℃?15秒、60℃?1分鐘，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)；

（4）根據(jù)熒光曲線讀取Ct值，按照下述公式計(jì)算HOTAIRM1的相對(duì)表達(dá)量：HOTAIRM1相對(duì)表達(dá)量=2^－ΔCt（ΔCt=Ct?_HOTAIRM1－Ct_?GAPDH）；

所述特異性內(nèi)外側(cè)引物和熒光探針的序列分別如下：

HOTAIRM1外側(cè)引物：

outer-hotiarm1-F:?GCTGGAGCGAAGAAGAGCAA，

outer-hotiarm1-R：CAAACACCCACATTTCAACCC；

HOTAIRM1內(nèi)側(cè)引物：

inner-hotiarm1-F：GAACTGGCGAGAGGTCTGTTTT，

inner-hotiarm1-R：CCCCATAAATCCCTCCACATT；

HOTAIRM1熒光探針：

hotiarm1-probe:?FAM-CCTGAACCCATCAACAGCTGGGAGA-TAMRA?

GAPDH外側(cè)引物：

outer-gapdh-F：GGCGCTGAGTACGTCGTGGA,?

outer-gapdh-R：GTGGTGCAGGAGGCATTGCTGAT；

GAPDH內(nèi)側(cè)引物：

inner-gapdh-F：GCGTCTTCACCACCATGGA，

inner-gapdh-R：TGGTTCACACCCATGACGAA；

GAPDH熒光探針為：

hotiarm1-probe:?FAM-CCTGAACCCATCAACAGCTGGGAGA-TAMRA。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)長(zhǎng)鏈非編碼RNA-HOTAIRM1的方法，其特征在于，?FAM為熒光報(bào)告基團(tuán)，TAMRA為熒光淬滅基團(tuán)。