[發明專利]高效表達HIF-1α基因的腸癌細胞株

無效

• 申請號: 201110392673.2
• 申請日: 2011-12-01
• 公開（公告）號: CN103131672A
• 公開（公告）日: 2013-06-05
• 發明（設計）人: 周利紅;李琦;范忠澤;王炎;殷佩浩;慈書俊;周寧;劉宣;隋華
• 申請（專利權）人: 上海市普陀區中心醫院
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/867;C12N15/66;C12R1/91
• 代理公司: 上海新天專利代理有限公司 31213
• 代理人: 王敏杰

技術領域

本發明涉及一種細胞株，尤其涉及一種高效表達HIF-1α基因的腸癌細胞株、及其制備方法，以及用于制備所述細胞株的慢病毒載體及其制備方法。?

背景技術

缺氧誘導因子1（hypoxia?inducible?factor?1，HIF-1）是HIFs家族中最先被發現的成員，由對氧敏感的α亞基和穩定表達的β亞基組成的異源二聚體，作為缺氧誘導的、連接在EPO基因低氧反應元件上的一個核因子，在腫瘤細胞增殖代謝、腫瘤血管發生、侵襲轉移和對藥物治療的反應中起著關鍵的調節作用。?

HIF-1α是HIF-1的調節及活性亞基，可被缺氧誘導表達，在細胞漿分泌后轉移到細胞核內與HIF-1β結合，激活下游靶基因，HIF-1的生物效應是主要由HIF-1α亞基介導實現。HIF-1α基因位于人染色體14q²¹-q²⁴區，全長3720bp，編碼826個氨基酸，分子量為120KD。HIF-1α含4個不同的結構域：（1）bHLH?和PAS?結構域，參與HIF-1二聚化和介導DNA?結合；（2）N-末端和C-末端的入核信號NLS，介導HIF-1α轉位入核；（3）氧依賴性降解區域ODD，介導HIF-1α的氧依賴性降解；（4）靠近N-末端的N-TAD?和靠近C-末端的C-TAD，介導HIF-1α的轉錄激活。C-TAD?和N-TAD?之間為抑制結構域，能降低TAD?的活性，常氧下該抑制明顯，兩個入核信號只有C端的NLS才能介導HIF-1a入核。?

缺氧狀態下，腫瘤為了適應低氧環境，在能量代謝、血管生成、侵襲轉移等方面產生了一系列的變化，HIF-1α就是啟動這一系列代謝和生物學行為改變的一個重要因子，在缺氧誘導的基因表達中起關鍵作用。研究發現，HIF-1α在腫瘤細胞中參與調控的功能基因多達100種，主要有：（1）調控腫瘤血管新生，如血管內皮生長因子（VEGF）、血管生成素2（Ang2）、誘導型一氧化氮合酶（iNOS）等；（2）參與糖代謝：糖酵解酶-11、醛縮酶A、葡萄糖載體1和3?等；（3）介導腫瘤侵襲、轉移：趨化因子受體4（CXCR4）、間質細胞衍生因子1（SDF1）、轉化生長因子β（TGFβ）等；（4）調節細胞凋亡：p53、BNIP3、RTP801等；（5）細胞增殖與分化：IGF2、EPO、TGF、FGF等。?

常氧狀態時，細胞在脯氨酰羥化酶（PHD）作用下，HIF-1α中氧依賴降解區域（ODD）多肽序列內保守性的脯氨酸殘基被羥化，導致HIF-1α可與VHL（Von?Hippel?Lindau）腫瘤抑制蛋白結合，通過蛋白酶體泛素化途徑被降解。在缺氧狀態下，細胞脯氨酰羥化反應受阻，HIF-1α未能羥基化而不能被VHL識別，因此HIF-1α不能被泛素化和被蛋白酶體降解，使其在細胞漿內呈指數增長。HIF-1α在胞漿內積聚、活化、轉位至核內，與HIF-1β形成具有轉錄活性的二聚體HIF-1，通過HIF-1α?C-末端的轉錄激活區域（C-TAD）誘導輔激活蛋白CBP/p300入核，p300-CBP復合物使HIF-1與CBP/?p300形成大分子復合物，并與受HIF-1α調控的靶基因的啟動子或增強子內的一個或多個低氧應答元件（HRE）上的HIF-1?結合位點（5′-TACGTG23′）結合，誘導缺氧反應基因的轉錄。?

HIF-1α在結直腸癌、胃癌、卵巢癌、胰腺癌等多種實體瘤中高表達，且轉移性腫瘤中的表達比原發性腫瘤明顯較高。HIF-1α的表達與腫瘤分期有關，臨床分期越晚HIF-1α蛋白陽性表達率越高，HIF-1α在腫瘤的發生發展、侵襲轉移和預后中起著關鍵的作用。目前研究認為，腫瘤缺氧狀態下HIF-1α可以通過與其下游DNA結合，調節靶基因mRNA的表達，但HIF-1α的靶基因多達上百種，被HIF-1α激活的眾多靶基因之間是如何相互作用、互相調節，目前研究的不多。HIF-1α自身活性的調控在很大的程度上決定了腫瘤細胞對氧分壓變化及細胞因子應答的敏感性及準確性，而在腫瘤中HIF-1α調控的信號通路研究仍不夠明確。基于HIF-1α的腫瘤信號轉導通路主要與腫瘤組織的缺氧狀態密切相關，以HIF-1α分子為中心的信號轉導通路還有很多是未知的。?