[發明專利]一種用于基因靶向傳遞的siRNA載體復合物及其制備方法

無效

• 申請號: 201110392143.8
• 申請日: 2011-12-01
• 公開（公告）號: CN102552936A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: 程國勝;張蓓蓓;于昊;宋琴
• 申請（專利權）人: 中國科學院蘇州納米技術與納米仿生研究所
• 主分類號: A61K48/00
• 分類號: A61K48/00;A61P35/00
• 代理公司: 南京蘇科專利代理有限責任公司 32102
• 代理人: 陳忠輝

技術領域

本發明涉及一種非病毒陽離子載體的基因治療組合物，更具體的說，涉及一種磁小體與陽離子載體siRNA載體復合的基因治療復合物，屬于納米材料生物醫學領域。

背景技術

RNA干擾（RNA?interference，RNAi）利用具有同源性的雙鏈RNA（double-stranded?RNA，dsRNA）降解與其序列互補配對的mRNA，沉默相應靶位基因的表達。隨著人們對RNAi分子機制理解的進一步深入，小干擾RNA（Small?interfering?RNA，siRNA）作為一種新型基因治療藥物，為癌癥等絕癥的治療帶來了希望。有效輸運是開發RNAi作為廣泛的治療平臺最具挑戰性的障礙。如何選擇合適的載體提高目標基因攜帶進入相關目標組織細胞的效率，并使其不被降解，是實現siRNA治療的難題。

目前，非病毒陽離子載體成為替代病毒載體作為基因載體的研究熱點。由于陽離子載體表面帶正電荷，細胞膜表面帶負電荷，兩者很容易結合，通過細胞的內吞作用形成內涵體被攝入到細胞內，陽離子載體的氨基可以結合質子，起pH值緩沖作用，保護進入內涵體的基因不被溶酶體酶降解，質子海綿效應使載體因進一步大量結合質子而膨脹，并伴隨高滲透壓引入的大量水分，導致內涵體破裂解體，將基因釋放出來。

趨磁細菌磁小體（Bacterial?magnetic?nanoparticles，BMPs）為趨磁細菌(Magnetotactic?bacteria)體內合成的含有單磁疇的氧化鐵或硫化鐵（Fe₃O₄或Fe₃S₄）晶體，大小均勻為納米級（20-100納米），在外加磁場的作用下有趨磁性，磁小體外有生物膜包被，因此有不團聚、無毒性、免疫原性低等特點，是作為藥物、基因等的理想載體。

因此，如何將非病毒陽離子載體與磁小體復合，作為合適的載體，實現siRNA治療成為急需解決的問題。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是，克服現有技術的缺點，提供一種提高目標基因攜帶進入相關目標組織細胞的效率，并使其不被降解的用于基因靶向傳遞的siRNA載體復合物。同時，本發明目的還旨在提供一種用于基因靶向傳遞的siRNA載體復合物的制備方法。

為了解決以上技術問題，本發明提供一種用于基因靶向傳遞的siRNA載體復合物，其特征在于，所述siRNA載體復合物為由磁小體、非病毒載體和目的siRNA組成的復合體系，其中所述目的siRNA為與疾病或癌癥相關的siRNA。

本發明進一步限定的技術方案是：所述磁小體為制取自趨磁細菌或現購的磁螺菌屬模式菌株AMB-1、格瑞菲斯瓦爾德磁螺菌MSR-1之一的鏈狀顆粒，其中所述趨磁細菌為從太湖水體淤泥中經富集和篩選得到。

進一步的：所述磁小體的粒徑大小為30～60納米。

進一步的：所述目的siRNA的長度為21-23個核苷酸。

進一步的：所述非病毒載體為聚乙烯亞胺、樹狀大分子、殼聚糖及其衍生物、和陽離子脂質體中的一種或一種以上，帶正電的非病毒載體與目的siRNA的磷酸骨架及帶負電的細胞膜表面相結合。

一種制備siRNA載體復合物的方法，包括步驟：Ⅰ、提純制備磁小體，并對純凈的磁小體進行γ射線照射滅菌，測定OD₆₆₀，定量制成備用物；

Ⅱ、設計并合成與疾病相關的目的siRNA，在緩沖液中稀釋保存，定量備用；

Ⅲ、選取一種或一種以上非病毒載體制成溶液，按非病毒載體中氨基N與目的siRNA中磷酸基P的適當比例混合，在一定溫度和pH值條件下靜置或振蕩，使目的siRNA和非病毒載體通過靜電或共價結合制成初級復合物；

Ⅳ、將步驟Ⅰ的備用物與步驟Ⅲ制得的初級復合物混合，在一定溫度和pH值條件下，通過靜電或共價結合，制得siRNA載體復合物。

以上制備方法進一步限定的技術方案是：步驟Ⅰ中所述的提純制備磁小體的方法為：采用超聲波破碎法或細胞壓榨機法破碎菌體并離心沉淀，用磁鐵吸附磁小體后再用磷酸緩沖液沖洗干凈。

進一步的：步驟Ⅰ中所述的測定OD₆₆₀的方法為吸光度法。

進一步的：步驟Ⅳ中備用物與初級復合物按其中磁小體與目的siRNA質量比為1:5～1:1混合。