[發明專利]一種利用復合酶生產活性東北林蛙膠原蛋白低聚肽的方法

有效

• 申請號: 201110391766.3
• 申請日: 2011-12-01
• 公開（公告）號: CN102492760A
• 公開（公告）日: 2012-06-13
• 發明（設計）人: 孫智謀;王海波;周旭;戚譯天
• 申請（專利權）人: 吉林省工致科技開發有限公司
• 主分類號: C12P21/06
• 分類號: C12P21/06
• 代理公司: 長春菁華專利商標代理事務所 22210
• 代理人: 南小平

技術領域

本發明涉及膠原蛋白低聚肽的制備領域，尤其涉及一種復合蛋白酶在最佳條件下酶解東北林蛙皮生產活性膠原蛋白低聚肽的方法。

背景技術

膠原蛋白低聚肽是膠原蛋白生物降解后的分子聚合物，由兩個或兩個以上氨基酸通過肽鍵連接而成。科學證實：人體皮膚的衰老就是膠原蛋白流失的過程。其對人的機體生理作用主要表現在：免疫調節、抗氧化、抗疲勞、廣譜抗菌、抗腫瘤等方面，可廣泛應用于醫藥、保健食品、化妝品等領域。目前，我國對膠原蛋白的需求每年約400噸。

膠原蛋白低聚肽主要來源可分為人工合成和膠原蛋白酶解兩種。人工合成膠原蛋白低聚肽技術要求高，成本高昂，市場化程度低，使用效果不穩定。膠原蛋白酶解避免了化學降解法的反應環境極端，丟失活性，化學試劑殘留等缺點。生物酶解后不僅具有穩定的活性和較強的生物相容性，更具有安全性高、過程易控制、分子量可控等優點。酶制劑的選擇是酶解法生產活性低聚肽的關鍵，目前主要生產工藝都是采用胃蛋白酶等單一酶，由于酶解單一使其提取率低下，生產成本高。因此尋找一種提取率高、活性高的酶制劑生產活性低聚肽具有重要的意義。

現有的一種方法是以林蛙皮為原料采用酸酶法提取膠原蛋白的方法，其方法采用酸酶結合提取，破壞一部分肽鍵，使得膠原變成可以被醋酸溶解的可溶性膠原蛋白，從而達到提取的目的。酸酶結合提取條件為質量比胃蛋白酶∶原料＝1∶50，提取溫度37℃，保溫時間72h，提取緩沖液50ml?0.5mol/L冰醋酸，提取兩次，最終的提取率可達到81.6％，膠原蛋白含量不少于26％。該工藝由于采用酸堿溶液破壞了膠原蛋白的活性，同時其工藝繁瑣、成本較高、膠原蛋白提取率低，工業化生產尚有差距。

另一種方法是利用海洋生物提取海洋膠原蛋白的方法，主要有熱水浸提法、酸法、堿法、鹽法及酶法等。目前，酶解海洋膠原蛋白主要有單酶法和多酶法，多酶法又分為混合酶解法和分步酶解法。國內關于海洋膠原蛋白酶解的研究也非常多，木瓜蛋白酶酶解魚皮得到短肽分子量為6000～29000D，該方法采用的單酶法提取率低下，分子量大且分散。

發明內容

本發明的目的是提供一種利用復合酶生產活性東北林蛙膠原蛋白低聚肽的方法，該方法首次將復合酶法應用到林蛙皮膠原蛋白低聚肽的提取過程中，避免了單一酶制劑的酶解低效性，同時保持了其生物活性并且提高了提取率和生物相容性。

為了實現上述目的，本發明的技術方案如下：

一種利用復合酶生產活性東北林蛙膠原蛋白低聚肽的方法，包括如下步驟：

第一步，將干的東北林蛙浸灰、軟化，8小時后，水洗至中性；

第二步，向第一步水洗后的東北林蛙中加入復合酶，其加入量為第一步所述干的東北林蛙重量的1％～5％，調節酶解溶液的PH值為5.5～8.5，酶解溶液的溫度為55℃～65℃，酶解2～3小時后，加熱至85℃，滅活20分鐘；

第三步，向第二步滅活后的溶液中加入重量為第一步所述干的東北林蛙重量的3％～5％的活性炭脫色，再經過超濾膜精制、濃縮，真空冷凍干燥，進而得到小分子活性林蛙膠原蛋白低聚肽。

本發明采用復合酶酶解東北林蛙皮的方法，可大幅度降低成本，酶解率為90％以上，提取率在30％以上，同比增長5％左右；酶解后提取純度可達90％～97％，能極大地減少對環境的污染并簡化操縱工序，在高效、環保方面優勢突出，適用于工業化生產；所制得的林蛙膠原蛋白低聚肽的分子量為800～1200D。

具體實施方式

下面結合實施例對本發明做進一步詳細說明。

本發明的方法是利用東北林蛙油產業的廢棄物-林蛙皮為原料，軟化去脂后通過兩種酶制劑復配的方式酶解生產活性林蛙膠原蛋白低聚肽。

實施例1

準確稱取干東北林蛙皮1kg，室溫下加水至完全浸泡林蛙皮，浸灰、軟化8小時，其中攪拌幾次，至皮完全軟化，表皮顏色完全溶出后，攪拌均勻，測定并調節pH值為6.8～7.2。

將物料轉入反應釜加熱至60～65℃時，加入質量為干東北林蛙重量1％的復合酶，復合酶為木瓜蛋白酶、動物蛋白水解酶按照1.5∶1進行復配，勻速攪拌，轉速為50轉/分鐘，酶解3小時。再經85℃，20分鐘滅酶，使用重量為干東北林蛙重量3％～5％的活性炭脫色，超濾膜精制，濃縮，真空冷凍干燥，得350g林蛙膠原蛋白低聚肽，提取率為35％，林蛙膠原蛋白低聚肽產品呈微黃色，復水時間短，水溶性好，低聚肽含量97％，重金屬1.8ppm。其中，超濾膜精制中的膜元件孔徑為10nm，工作壓力為0.5MPa，工作溫度為40℃；動物蛋白水解酶為堿性蛋白水解酶或胃蛋白水解酶。