[發(fā)明專利]一種檢測大熊貓糞樣中西氏貝蛔蟲蟲卵的PCR法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110390473.3
• 申請日: 2011-11-30
• 公開（公告）號: CN102392079A
• 公開（公告）日: 2012-03-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 楊光友;周旋;王凝;古小彬;王淑賢;彭雪蓉
• 申請（專利權(quán)）人: 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 成都信博專利代理有限責(zé)任公司 51200
• 代理人: 卓仲陽

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種西氏貝蛔蟲蟲卵檢測的方法，具體涉及一種使用PCR擴增手段檢測西氏貝蛔蟲蟲卵的方法。

背景技術(shù)

大熊貓是我國的國寶。西氏貝蛔蟲(Baylisascaris?schroederi)是野生和圈養(yǎng)大熊貓較為常見的一種腸道寄生蟲，成蟲通常寄生于大熊貓的小腸，以粘膜表面物質(zhì)及半消化的食物為食，不僅直接奪取大量的營養(yǎng)，而且嚴重影響蛋白質(zhì)、脂肪、糖類及維生素的吸收，引起大熊貓營養(yǎng)不良、貧血等癥狀。大量蟲體的寄生將導(dǎo)致腸梗阻、腸穿孔或腸套疊，有時也可鉆入胰管和膽管內(nèi)，引起阻塞及炎癥，嚴重時極易導(dǎo)致死亡。西氏貝蛔蟲卵的受精蟲卵在顯微鏡下呈深褐色橢圓形，兩極極圓，邊緣不規(guī)則，有乳頭狀突起，為蛋白質(zhì)膜。蟲卵蛋白質(zhì)膜特別厚，使蟲卵對各種理化物質(zhì)和不良的外界環(huán)境具有很強的抵抗力。

大熊貓蛔蟲病的臨床癥狀不具備特異性，到目前為止，對大熊貓蛔西氏貝蛔蟲病的診斷仍以漂浮法檢查糞便中的蟲卵。但由于大熊貓以竹子為主食且日食量大，使得每天的排糞量達到10-13kg，由此糞便中的蟲卵密度較低，同時大熊貓糞便中的植物纖維含量很高對蛔蟲卵的檢查有很大的干擾，因此大熊貓蛔蟲卵在采用常規(guī)糞便檢查中較難檢出，因而檢測結(jié)果的準確率較低。在生產(chǎn)中，常出現(xiàn)糞便檢查蛔蟲卵為陰性的大熊貓，也可能會突然嘔吐出大量的蛔蟲。因此，建立一種準確、靈敏的檢測方法是大熊貓蛔蟲病防治工作中的關(guān)鍵。

對于任何一種PCR方法，DNA模板的質(zhì)量的高低是決定DNA擴增是否成功的關(guān)鍵因素之一，西氏貝蛔蟲的蟲卵與別的蟲卵不同之處在于該蛔蟲的蟲卵有一層堅硬、質(zhì)密的蛋白質(zhì)外殼和抗?jié)B透性脂質(zhì)層，因此給蟲卵提取DNA造成了一定的影響。同時，貝蛔蟲蟲卵DNA含量少，抽提DNA的難度非常大。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明目的在于提供一種準確、靈敏的大熊貓糞樣中西氏貝蛔蟲蟲卵檢測方法。

為解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是，提供一種檢測大熊貓糞樣中西氏貝蛔蟲蟲卵的PCR法，包括設(shè)計上游引物和下游引物、提取蟲卵DNA、PCR擴增和結(jié)果檢查四個步驟：

步驟a)：引物設(shè)計

根據(jù)大熊貓西氏貝蛔蟲線粒體12s基因的全序列進行有檢測價值的基因片段的篩選并設(shè)計引物，用Primer5.0分析軟件分析其可行性，設(shè)計上下游引物：

上游引物：5’-TTTTACCTTGGCATTTTGTC-3’，

下游引物：5’-CTCTCAATTACTACTCAACCTCC-3’，

檢測目的基因片段長度為291bp，該片段的基因序列如表1：12s擴增目的片段序列所示；

步驟b)：提取蟲卵DNA

將大熊貓的糞樣用濾糞網(wǎng)過濾后的糞液取出1ml于離心管中，12000r/min離心5min，倒掉上清液，再從糞樣中取500μl于離心管中，再次12000r/min離心5min，倒掉上清液，如此反復(fù)，直到離心管中的糞渣占離心管總體積的1/5；

將離心管于100℃沸水和液氮中交替放置1min，經(jīng)過10次的反復(fù)充分凍融后，在漩渦震蕩儀上震蕩10min，用常規(guī)酚氯仿法提取DNA；

步驟c)：PCR擴增

糞樣DNA為PCR模板，以線粒體12s基因序列設(shè)計的特異性引物擴增291bp的目的片段，從而探索PCR對糞樣中大熊貓西氏貝蛔蟲蟲卵12s基因的PCR擴增產(chǎn)物，為了減少糞便中PCR抑制物對PCR的影響，加入0.4％的N，O-雙三甲硅基乙酰胺；

PCR體系：糞樣DNA為模板1.5μl，上下游引物各1.5μl，2×Taq?PCR?Master混合制劑12.5μl，滅菌雙蒸水8μl，0.4％N，O-雙三甲硅基乙酰胺；所述2×TaqPCR?Master混合制劑成分主要有：0.1U?Taq?Polymerase/ul，500uM?DNTP?each，20mM?Tris-HCL/PH?8.3，100mM?KCL，3mM?MgCL₂。

PCR程序：95℃變性5min后進入循環(huán)；變性溫度95℃，時間30s；退火溫度50℃，時間30s；延伸溫度72℃，時間30s；重復(fù)35個循環(huán)后72℃最后延伸10min。或者95℃變性5min后進入循環(huán)；變性溫度95℃，時間30s；退火溫度50℃，時間30s；延伸溫度72℃，時間30s；重復(fù)35個循環(huán)后72℃最后延伸10min。

步驟d)：結(jié)果檢查

PCR產(chǎn)物通過常規(guī)方法進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，用紫外透射儀觀察結(jié)果，觀察到特異性條帶即表明糞便中存在西氏貝蛔蟲蟲卵。