[發(fā)明專利]一種檢測(cè)大熊貓糞樣中西氏貝蛔蟲(chóng)蟲(chóng)卵的PCR法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110390473.3
• 申請(qǐng)日: 2011-11-30
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102392079A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-03-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊光友;周旋;王凝;古小彬;王淑賢;彭雪蓉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 成都信博專利代理有限責(zé)任公司 51200
• 代理人: 卓仲陽(yáng)

1.一種檢測(cè)大熊貓糞樣中西氏貝蛔蟲(chóng)蟲(chóng)卵的PCR法，包括設(shè)計(jì)上游引物和下游引物、提取蟲(chóng)卵DNA、PCR擴(kuò)增和結(jié)果檢查四個(gè)步驟，其特征在于：

步驟a)：所述上游引物是5’-TTTTACCTTGGCATTTTGTC-3’，下游引物是5’-CTCTCAATTACTACTCAACCTCC-3’，檢測(cè)基因片段長(zhǎng)度為291bp；

步驟b)：定量糞樣用濾糞網(wǎng)過(guò)濾后取出1ml于離心管中，離心后倒掉上清液，再?gòu)募S樣中取500μl于離心管中，再次離心后倒掉上清液，如此反復(fù)直到離心管中的糞渣占離心管總體積的1/5；

將離心管于沸水和液氮中交替放置1min，經(jīng)過(guò)數(shù)次的反復(fù)充分凍融，用常規(guī)酚氯仿法提取DNA；

步驟c)：利用步驟a)所述的引物擴(kuò)增步驟b)提取的DNA；

步驟d)：PCR產(chǎn)物通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用紫外透射儀觀察結(jié)果。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)大熊貓糞樣中西氏貝蛔蟲(chóng)蟲(chóng)卵的PCR法，其特征在于：步驟c)中PCR擴(kuò)增體系為糞樣DNA模板1.5μl，上下游引物各1.5μl，2×Taq?PCR?Master混合制劑12.5μl，滅菌雙蒸水8μl，0.4％N，O-雙三甲硅基乙酰胺；并按照以下程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增：94-95℃變性5min后進(jìn)入循環(huán)；變性溫度94-95℃，時(shí)間30s；退火溫度48-50℃，時(shí)間30s；延伸溫度72℃，時(shí)間30s；重復(fù)35個(gè)循環(huán)后72℃最后延伸10min。

3.根據(jù)權(quán)利要求1-2任一權(quán)利要求所述的檢測(cè)大熊貓糞樣中西氏貝蛔蟲(chóng)蟲(chóng)卵的PCR法，其特征在于，步驟a)中所述的上下游引物用以下上下游引物代替，上游引物是5’-GAGTAAGAAGGTTGAGTATCAGTTT-3’，下游引物是5’-ATGAATAACATCCCCAGAAGTA-3’，檢測(cè)基因片段長(zhǎng)度為331bp。