[發明專利]一種防止拜氏梭菌菌株退化的方法

無效

• 申請號: 201110389426.7
• 申請日: 2011-11-30
• 公開（公告）號: CN102517229A
• 公開（公告）日: 2012-06-27
• 發明（設計）人: 韓蓓;撒迪厄斯伊則吉;張瑞娟
• 申請（專利權）人: 西安交通大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12R1/145
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責任公司 61200
• 代理人: 陸萬壽

技術領域：

本發明屬于生物醫藥領域，涉及一種防止拜氏梭菌菌株退化的方法，尤其是一種拜氏梭菌人工退化菌株模型及一種防止菌株退化的方法。

背景技術：

在分解糖產酸的梭狀芽孢桿菌屬種，有一些種類的細菌可以在一定條件下在生長后期產中性溶劑(丙酮acetone、丁醇butanol、乙醇ethanol，常被稱為ABE)。1861年巴斯德首次發現細菌可以產生丁醇，1912年Weizmann發現梭菌Clostridium?acetobutylicum可以轉化淀粉產生丙酮、丁醇、乙醇，1990年以前這些細菌被統稱為產丙酮丁醇梭菌(Clostridium?acetobutylicum)，后來通過16s?rRNA等進一步分類，分出其他3種生長條件相同、產溶劑種類產量類似的C.beijerinckii，C.saccharobutylicum，C.saccharoperbutylacetonicum.這也就是主要產溶劑的四種梭菌，屬于梭狀芽孢桿菌屬(Clostridium)。目前主要的丙酮丁醇發酵菌株為丙酮丁醇梭菌C.acetobutylicum?ATCC824和拜氏梭菌C.beijerinckii?NCIMB8052，并且這兩株菌的全基因組序列分別于2001年和2007年測定完成。近年來，利用厭氧梭菌發酵法生產生物丁醇作為很有潛力的液體燃料成為研究熱點。

拜氏梭菌，革蘭氏陽性細菌，嚴格厭氧，可利用普通淀粉(玉米、小麥、谷類等)、糖類作為發酵底物進行厭氧發酵產溶劑，一般來講，定量發酵中，ABE產量(12-20g/L)為20-30％丙酮，60-70％丙醇和10％的乙醇。其代謝過程過程分為2個階段：產酸階段，此階段產酸途徑被激活，乙酸、丁酸、ATP、H₂、CO₂為主要代謝產物，培養基的pH從6.3迅速下降至4.5。產酸階段細胞將游離有機酸分泌至胞外，當培養基中的游離有機酸濃度與電離的酸根離子達到平衡，培養基的緩沖能力降低，細胞生長受到一定抑制；細胞進入芽孢生長期的同時也進入產溶劑階段，培養基中的游離有機酸被重新吸收進細胞內合成為丙酮和丁醇。溶劑產生過程主要由acetoacetyl-CoA：acetate/butyrate-coenzymeA?transferase(CoA?transferase)和其他幾種butyraldhyde/butanol?dehydrogenase，acetoacetate?decarboxylase所催化。細胞從產酸代謝向產溶劑代謝的轉變，芽孢形成與溶劑產生的關聯和調控是目前產溶劑代謝途徑研究的熱點問題，對產溶劑期相關酶的增強轉錄及誘導表達及產酸期相關酶的抑制的機制和途徑被認為是這個轉折點的關鍵。

在產溶劑梭菌的厭氧發酵過程中的菌株退化(degeneration)是目前研究的一個重要方面，也是限制其規模發酵的一個重要因素，其表現為在連續傳代中菌株完全或者部分喪失了產溶劑的能力，并且是不可逆的。細胞一直處于產酸生長期，胞外積累大量的有機酸，細胞不能進入產溶劑期，這些有機酸沒有被重新吸收轉化，過量的有機酸使得細胞中毒死亡。在C.acetobutylicum?ATCC824中，大質粒pSOL1上含有產溶劑期相關酶基因(aad、ctfA、ctfB)，連續培養中該質粒的丟失被認為是造成菌株退化的直接原因，退化菌株C.acetobutylicum中外源表達這些基因則可恢復丁醇的產量達野生型的50％左右；在C.beijerinckii?NCIMB8052中也出現不可逆的菌株退化、不產溶劑現象的出現，但是C.beijerinckii?NCIMB8052細胞中并沒有大質粒，所有的與產溶劑相關的基因都位于基因組上；同時退化的C.beijerinckii?NCIMB8052菌株中可以檢測到產溶劑期相關酶基因序列的存在。因此，不同的產溶劑梭菌具有不同的控制產溶劑退化的機制，而在C.beijerinckii?NCIMB8052中這個調控機制是未知的，因此迫切需要研究其菌株退化發生機制，并找出有效控制菌株退化的方法。

目前的研究并沒有關于C.beijerinckii菌株退化機制的相關報道，并且對于已發生退化的菌株并沒有有效的技術手段使其恢復產溶劑代謝的能力。

發明內容：

本發明的目的在于克服上述現有技術的缺點，提供一種防止拜氏梭菌菌株退化的方法，以C.beijerinckii?NCIMB8052位研究對象，人工獲得退化菌株模型，研究退化菌株的代謝，并通過碳酸鹽來調節細胞外游離的有機酸的濃度來恢復退化菌株產溶劑的能力。