[發明專利]HIV重組融合抗原及其表達基因和制備方法

有效

• 申請號: 201110389340.4
• 申請日: 2011-11-29
• 公開（公告）號: CN102492041A
• 公開（公告）日: 2012-06-13
• 發明（設計）人: 王繼華;周臘梅;唐時幸
• 申請（專利權）人: 廣州萬孚生物技術有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/70;G01N33/569;C12R1/19;C12R1/93
• 代理公司: 廣州華進聯合專利商標代理有限公司 44224
• 代理人: 萬志香;曾旻輝

1.一種HIV重組融合抗原，其特征是，其由SEQ?ID?NO.1所示氨基酸、連接子以及SEQ?ID?NO.3所示氨基酸順次組合構成，所述連接子為6-10個分子量小的、極性且親水的氨基酸構成。

2.根據權利要求1所述的HIV重組融合抗原，其特征是，所示連接子的氨基酸組成如SEQ?ID?NO.2所示。

3.一種編碼權利要求1所示的HIV重組融合抗原的表達基因，其特征是，包括a：其核苷酸序列由SEQ?ID?NO.4和編碼連接子的堿基序列和SEQ?ID?NO.6所組成；b：與a的核苷酸序列編碼相同序列的蛋白質，但因遺傳密碼的簡并性而與a的核苷酸序列不同的序列；C：對上述a或b所示核苷酸序列進行一個或多個堿基的取代、缺失、添加修飾的核苷酸序列。

4.根據權利要求3所述的表達基因，其特征是，所述編碼連接子的堿基序列如SEQ?ID?NO.5所示。

5.一種權利要求1所述HIV重組融合抗原的制備方法，其特征是，其步驟如下：

(1)將權利要求3所述編碼融合抗原的表達基因序列合成，克隆連入pMD18-T?simple?Vector載體，得到含目的基因的T載體；

(2)T載體經BamH?I和HindIII雙酶切，酶切產物純化回收，與經BamH?I和HindIII酶切過的質粒pET-28a連接；

(3)熱激法將連接產物轉化感受態大腸桿菌E.coli?DH5α株，涂布于含34-55μg/ml?Kan的LB平板，篩選得到陽性質粒；

(4)重組蛋白表達工程菌株的構建與誘導表達：采用CaCl₂將測序正確的陽性質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，培養；挑取單菌落接種至含34-55μg/ml?Kan的5mL?LB液體培養基中，37℃，震蕩培養過夜；次日，轉接于新鮮LB培養基中，37℃，震蕩培養至OD₆₀₀值約為0.6時加入IPTG至終濃度1.0mM，誘導培養3-4h，SDS-PAGE檢測重組蛋白的表達，得到HIV重組融合抗原。

6.根據權利要求5所述的制備方法，其特征是，所述制備方法還包括對HIV重組融合抗原的純化：將包涵體形式的HIV重組融合抗原在0.5％-1％的中性去垢劑用脲素梯度反復多次洗滌初步純化，變性溶解，利用金屬螯合層析法親和層析。

7.根據權利要求6所述的制備方法，其特征是，所述溶解液為：pH8.0，20mM?Tris，1％tween-20，8M脲。

8.根據權利要求6所述的制備方法，其特征是，對純化后的HIV重組融合抗原進行復性，復性液包括有：20mM?Tris-Cl，pH8.0，2mMEDTA，5％蔗糖，0.1％tween-20，0.02％NaN₃。

9.根據權利要求5-8任一項所述的制備方法，其特征是，所述HIV重組融合抗原的保存液包括有：20mM?Tris-Cl，pH8.0，2mM?EDTA，5％蔗糖，0.1％tween-20，0.02％NaN₃。