[發(fā)明專利]一種動(dòng)物狂犬病中和抗體ELISA檢測試劑盒及其應(yīng)用

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110388138.X
• 申請(qǐng)日: 2011-11-29
• 公開（公告）號(hào): CN102520169A
• 公開（公告）日: 2012-06-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王海霞;陳靜;岳雷;李淑芬;張振山
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 唐山怡安生物工程有限公司
• 主分類號(hào): G01N33/569
• 分類號(hào): G01N33/569;G01N33/531
• 代理公司: 北京路浩知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛;王加嶺

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種用間接酶聯(lián)免疫吸附方法(ELISA)檢測動(dòng)物狂犬病中和抗體的試劑盒及其制備方法。

背景技術(shù)

狂犬病是由狂犬病病毒(Rabies?virus，RV)感染引起的人畜共患的急性高度致死性傳染病，廣泛流行于世界各地，據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)最新的不完全統(tǒng)計(jì)資料報(bào)道，全世界每年約有5.5萬人死于狂犬病，我國每年的死亡人數(shù)位列世界第二位，且最近幾年死亡人數(shù)居高不下。而正是狂犬病病毒在動(dòng)物之間的傳播流行直接導(dǎo)致了人狂犬病的流行，預(yù)防人得狂犬病，首先應(yīng)當(dāng)控制和消滅動(dòng)物得狂犬病，即消滅傳染源。因此要從根本上預(yù)防狂犬病的發(fā)生，控制和消滅狂犬病必須對(duì)犬和野生動(dòng)物實(shí)行全面的綜合預(yù)防措施。研究表明狂犬病的控制，最積極有效的措施就是加強(qiáng)犬的免疫。

疫苗接種后，并不是所有動(dòng)物都會(huì)產(chǎn)生免疫反應(yīng)，產(chǎn)生抗狂犬病毒抗體。只有經(jīng)過檢測，產(chǎn)生了達(dá)到保護(hù)水平的狂犬病毒抗體的動(dòng)物才能確保不發(fā)生狂犬病。評(píng)價(jià)狂犬病疫苗的免疫效果，主要以免疫后出現(xiàn)抗狂犬病毒抗體為指標(biāo)，尤其抗體出現(xiàn)的時(shí)間、水平和持續(xù)時(shí)間更為重要。因此應(yīng)該在接種疫苗后一個(gè)月，進(jìn)行狂犬病毒抗體檢測，如果不能產(chǎn)生保護(hù)性狂犬病毒抗體，就應(yīng)該重新或加強(qiáng)免疫，確保免疫效果。WHO狂犬病專家委員會(huì)推薦小鼠中和實(shí)驗(yàn)(MNT)和快速熒光灶抑制實(shí)驗(yàn)(RFFIT)作為檢測狂犬病毒(RV)中和抗體的兩項(xiàng)基本方法，并為其它方法的基準(zhǔn)和參考。但是，無論是MNT法還是RFFIT法，分別需要21d和2d以上的實(shí)驗(yàn)觀察時(shí)間，需要組織細(xì)胞培養(yǎng)和昂貴的熒光顯微鏡來配合使用，進(jìn)行試驗(yàn)結(jié)果的判斷。熒光抗體病毒中和試驗(yàn)(FAVN)操作繁瑣，對(duì)操作者操作技能要求高，且存在生物安全和人為判斷誤差的問題。

ELISA是一種基于抗原抗體特異性反應(yīng)的檢測方法，其優(yōu)點(diǎn)是敏感、特異、安全、操作簡單快速，在很多疾病的臨床診斷與流行病學(xué)調(diào)查等方面得到了廣泛的應(yīng)用，適用于大批量標(biāo)本的檢測，是較為理想的病原或抗體檢測方法。ELISA檢測方法對(duì)包被抗原的純度要求較高，現(xiàn)有技術(shù)中純化狂犬病毒的方法主要有離子交換層析純化法、凝膠(分子篩)層析純化法等，其不足之處是抗原純度較低，且操作復(fù)雜，不利于保持生物大分子活性和節(jié)約成本，因此尋找一種經(jīng)濟(jì)、簡便、高效純化狂犬病病毒的方法成為制備檢測狂犬病中和抗體ELISA試劑盒的迫切需要。

法國Synbiotics公司生產(chǎn)的狂犬病抗體檢測試劑盒是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)唯一推薦的ELISA檢測試劑盒，但該試劑盒價(jià)格昂貴，為8800元人民幣，導(dǎo)致檢測成本高不利于推廣使用。開發(fā)一種可以快速準(zhǔn)確，成本較低的ELISA檢測方法測定狂犬病中和抗體具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，且對(duì)于構(gòu)建動(dòng)物防疫監(jiān)測體系和保障公共衛(wèi)生安全意義重大。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供檢測動(dòng)物狂犬病中和抗體間接ELISA檢測試劑盒及其應(yīng)用。

本發(fā)明試劑盒酶標(biāo)板的包被抗原為狂犬病病毒全病毒顆粒，該抗原是采用微載體懸浮培養(yǎng)的狂犬病毒收獲液經(jīng)過超濾、澄清、滅活、線性蔗糖梯度區(qū)帶離心純化后得到的。

本發(fā)明使用的狂犬病病毒為狂犬病毒固定毒(CTN-1株)，在Vero細(xì)胞上培養(yǎng)、擴(kuò)增，經(jīng)超濾、澄清、線性蔗糖梯度區(qū)帶離心濃縮提取，包括以下步驟：

1)微載體上Vero細(xì)胞長成單層后，按0.03～0.3感染復(fù)數(shù)的比例接種狂犬病毒，在溫度32～36℃、轉(zhuǎn)速20～80r/min、pH?7.20～7.80、溶氧20％～70％、添加0.05％～5％牛血清白蛋白的199培養(yǎng)基的條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)4-6日后開始收獲上清液至細(xì)胞完全脫落為止；

2)將病毒收獲液用0.1～0.45μm濾芯過濾澄清后，用100KD～300KD膜包，超濾濃縮；

3)向狂犬病毒濃縮液中加入β-丙內(nèi)酯，在2～8℃條件下滅活，37℃水解；

4)狂犬病毒滅活液用線性蔗糖梯度進(jìn)行區(qū)帶離心，4℃，20000～50000r/min；離心1～5小時(shí)，離心后泵入60％蔗糖溶液，收集狂犬病毒富集峰，得到的狂犬病毒離心液用截留分子量為100KD～300KD膜包超濾濃縮，PBS溶液透析脫糖，得到狂犬病毒純化液。

本發(fā)明試劑盒還包括：酶標(biāo)二抗、樣品稀釋液、標(biāo)準(zhǔn)血清、陽性血清、陰性血清、顯色劑、終止液和洗滌液。