[發明專利]一種動物狂犬病中和抗體ELISA檢測試劑盒及其應用

無效

• 申請號: 201110388138.X
• 申請日: 2011-11-29
• 公開（公告）號: CN102520169A
• 公開（公告）日: 2012-06-27
• 發明（設計）人: 王海霞;陳靜;岳雷;李淑芬;張振山
• 申請（專利權）人: 唐山怡安生物工程有限公司
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/531
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛;王加嶺

1.一種檢測動物狂犬病病毒中和抗體的酶聯免疫吸附試劑盒，其特征在于，酶標板包被原為狂犬病毒經線性蔗糖梯度區帶離心純化得到的狂犬病全病毒顆粒。

2.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的線性蔗糖梯度區帶離心純化狂犬病病毒的方法，其步驟為：

1)微載體上Vero細胞長成單層后，按0.03～0.3感染復數的比例接種狂犬病毒，在溫度32～36℃、轉速20～80r/min、pH?7.20～7.80、溶氧20％～70％、添加0.05％～5％牛血清白蛋白的199培養基的條件下培養，培養4～6日后開始收獲上清液至細胞完全脫落為止；

2)將病毒收獲液用0.1～0.45μm濾芯過濾澄清后，用100KD～300KD膜包超濾濃縮；

3)向狂犬病毒濃縮液中加入β-丙內酯，在2～8℃條件下滅活，37℃水解；

4)狂犬病毒滅活液用線性蔗糖梯度進行區帶離心，4℃，20000～50000r/min；離心1～5小時，離心后泵入60％蔗糖溶液，收集狂犬病毒富集峰，得到的狂犬病毒離心液用截留分子量為100KD～300KD膜包超濾濃縮，PBS溶液透析脫糖，得到狂犬病毒純化液。

3.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括酶標二抗、樣品稀釋液、標準血清、陽性血清、陰性血清、顯色劑、終止液和洗滌液。

4.如權利要求1～3任一所述的試劑盒，其特征在于，所用的狂犬病病毒來自狂犬病毒固定毒CTN-1株。

5.如權利要求1～3任一所述的試劑盒，其特征在于，所述酶標二抗為酶標羊抗犬IgG；所述酶標羊抗犬抗體的標記酶為辣根過氧化物酶。

6.如權利要求1～3任一所述的試劑盒，其特征在于，所述標準血清，其制備包括：將狂犬病病毒滅活抗原三針免疫程序接種比格犬，當血清效價高于6.0IU/ml時，1周后采血分離血清，56℃滅活30min獲得；所述陽性血清為狂犬病病毒滅活抗原免疫犬后獲得的血清，測定血清狂犬病毒抗體水平；所述陰性血清為未感染狂犬病病毒且未免疫過狂犬病疫苗的健康犬血清。

7.如權利要求1～3任一所述的試劑盒，其特征在于，當標記酶為辣根過氧化物酶時，所述顯色劑由底物A液和底物B液組成，底物液A液含有檸檬酸鈉、雙氧水，底物B液為TMB；所述終止液為2mol/L硫酸溶液；所述洗滌液為含有1％的Tween-20的PBS緩沖液。

8.一種制備權利要求1～7任一所述試劑盒的方法，其特征在于制備方法包括：

1)狂犬病病毒滅活后，用線性蔗糖梯度區帶離心純化，純化的狂犬病全病毒顆粒與包被緩沖液配成合適濃度，包被酶標板；

2)辣根過氧化物酶標記羊抗犬IgG，獲得酶標二抗；

3)狂犬病抗體檢測陰陽性對照血清的制備，按常規方法制備狂犬病抗體檢測陰性對照血清、狂犬病抗體檢測陽性對照血清和狂犬病抗體標準血清；

4)配制試劑，按配方配制封閉液、洗滌液、樣品稀釋液、酶標二抗稀釋液、底物顯色液、終止液；

5)試劑盒組裝，將純化的狂犬病全病毒顆粒包被的酶標板、酶標二抗、狂犬病抗體檢測陰陽性對照血清、標準血清及封閉液、洗滌液、樣品稀釋液、酶標二抗稀釋液、底物顯色液、終止液按試劑盒配制定量分裝。

9.如權利要求8所述的方法，其中步驟1)所述的純化狂犬病全病毒的包被濃度為2μg/ml。

10.權利要求1～7任一項所述的試劑盒在檢測動物狂犬病病毒中和抗體中的應用。