[發(fā)明專利]一種檢測氨基苷類抗生素單克隆抗體及其試劑盒

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110387247.X
• 申請日: 2011-11-29
• 公開（公告）號: CN102776151A
• 公開（公告）日: 2012-11-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 楊建軍;徐曉立;于軍
• 申請（專利權(quán)）人: 塔里木大學(xué)
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20;C07K16/44;G01N33/577;C12R1/91
• 代理公司: 烏魯木齊新科聯(lián)專利代理事務(wù)所(有限公司) 65107
• 代理人: 歐詠

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其針對抗氨基苷類抗生素通用單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的制備方法，已及獲取對其殘留的檢測試劑盒。?

背景技術(shù)

氨基苷類抗生素是由二個或三個氨基糖分子和一個的氨基環(huán)醇通過醚鍵連接而成，主要包括鏈霉素、慶大霉素、新霉素、妥布霉素、卡那霉素、阿米卡星、奈替米星等，是一類廣譜抗生素，對結(jié)核桿菌、鉤端螺旋體、放線菌及多種革蘭氏陰性桿菌具有較強的殺菌作用，在畜牧業(yè)生產(chǎn)中也常添加到飼料中促進生長發(fā)育。同時，氨基苷類抗生素極易產(chǎn)生交叉耐藥性，例如，原先對1ug/ml濃度鏈霉素敏感的大腸桿菌，經(jīng)過3-4天治療后，可以耐受100ug/ml的濃度，因此在農(nóng)副業(yè)生產(chǎn)中用量越來越大。而該類抗生素為對人腦、神經(jīng)、聽覺以及腎臟產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用。例如，德國從2002年6月1日起，將鏈霉素殘留限量標(biāo)準(zhǔn)由原來的0.2mg/kg提高到0.02mg/kg，導(dǎo)致目前所有的歐盟國家都將按此標(biāo)準(zhǔn)來控制，而對我國蜂蜜的檢測情況看，絕大部分都高于這一標(biāo)準(zhǔn)，因而導(dǎo)致我國蜂蜜不能出口到歐盟國家或只能降價銷售,使我蜂蜜出口商和生產(chǎn)商嚴(yán)重虧損。隨著對食品安全問題的重視，我國在1990年11月頒布的?《乳與乳制品衛(wèi)生管理辦法》及農(nóng)業(yè)部于2002年發(fā)布的《動物性食品中獸藥最高殘留限量》的通知，均對氨基苷類抗生素的最高殘留限量?（MRLs）作出了規(guī)定;因此加強對食品中各種藥物殘留的監(jiān)控已成為重塑我國食品安全信心的重要手段。?

文獻檢索披露：2003年歐盟及第三方國家基準(zhǔn)實驗室(NRL)聯(lián)合舉行的使用ELISA方法來檢測牛奶中的氨基糖苷類抗生素殘留協(xié)同試驗，各參加實驗室使用內(nèi)部ELISA方法或使用商業(yè)試劑盒（由Eurodiagnostica?、r-Biopharm和Tecna等公司提供）對提供的12支樣本進行測試,通過對靈敏度、特異性、回和收率等參數(shù)的考核，證明所使用的ELISA方法可以用來初篩定性檢測使用。?

本發(fā)明構(gòu)思的制備方法，利用所制備的單克隆抗體，建立氨基苷類抗生素殘留的ELISA快速檢測技術(shù)及試劑盒；同時提供的單克隆雜交瘤細(xì)胞株已被中國典型生物保藏中心保藏，號為CCTCC?C201135。該單克隆抗體具有特異性強、親和力高的優(yōu)點，與其它抗生素?zé)o交叉反應(yīng)，而與鏈霉素、新霉素、慶大霉素，卡那霉素等氨基苷類抗生素具有極高親和力。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目在于：提供的檢測氨基苷類抗生素殘留的方法，苷類抗生素殘留檢測試劑盒中的運用，[微軟用戶1]?能夠保證氨基苷類抗生素殘留檢測過程中的靈敏度和特異性。?

本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的：1）獲得具有保藏號為CCTCC?C201135的單克隆雜交瘤細(xì)胞株P(guān)ami-SP20；2）一種抗氨基苷類抗生素的單克隆抗體Pami-SP20-antibody，由雜交瘤細(xì)胞株P(guān)ami-SP20產(chǎn)生的抗體為IgG1亞型，可特異性識別氨基苷類抗生素，并具有較強的親和力；3）一種檢測氨基苷類抗生素殘留的試劑盒，利用保藏號為CCTCC?C201135的單克隆雜交瘤細(xì)胞株所分泌的單克隆抗體，獲取氨基苷類抗生素的檢測方法及試劑盒。?

本發(fā)明構(gòu)思的技術(shù)路線：?

1）采用碳二亞胺（Carbodiimide，EDC）法，將鏈霉素（Streptomycin，SM)與卵清蛋白(ovalbumin，OVA)?偶聯(lián)，合成了鏈霉素完全抗原SM-OVA，用于Balb/c小鼠免疫。

2）碳二亞胺（Carbodiimide，EDC）法，將鏈霉素（Streptomycin，SM)與牛血清白蛋白(Bovine?Serum?Albumin，BSA)偶聯(lián)，合成鏈霉素完全抗原SM-BSA，用于單克隆抗體的ELISA篩選；?

3）用PEG1500將經(jīng)SM-OVA免疫的Balb/c小鼠脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合，經(jīng)HAT選擇培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)后，SM-BSA包被酶標(biāo)板，篩選陽性克隆，陽性克隆經(jīng)三輪有限稀釋單克隆化后，擴大培養(yǎng)；

4）所獲單克隆抗體，進一步western?blot及ELISA驗證其特異性，并采用SIGMA公司單抗亞型鑒定試劑盒進行亞型鑒定；

5）陽性單克隆雜交瘤細(xì)胞注射Balb/c小鼠制備所需單克隆抗體腹水。