[發明專利]一種檢測氨基苷類抗生素單克隆抗體及其試劑盒

無效

• 申請號: 201110387247.X
• 申請日: 2011-11-29
• 公開（公告）號: CN102776151A
• 公開（公告）日: 2012-11-14
• 發明（設計）人: 楊建軍;徐曉立;于軍
• 申請（專利權）人: 塔里木大學
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20;C07K16/44;G01N33/577;C12R1/91
• 代理公司: 烏魯木齊新科聯專利代理事務所(有限公司) 65107
• 代理人: 歐詠

1.有保藏號為CCTCC?C201135的單克隆雜交瘤細胞株Pami-SP20。

2.一種抗氨基苷類抗生素的單克隆抗體Pami-SP20-antibody，其特征在于：由具有保藏號為CCTCC?C201135的雜交瘤細胞株Pami-SP20產生，所述抗體為IgG1亞型，可特異性識別氨基苷類抗生素，并具有較強的親和力。

3.一種檢測氨基苷類抗生素殘留的試劑盒，其特征在于：利用保藏號為CCTCC?C201135的單克隆雜交瘤細胞株所分泌的單克隆抗體，獲取氨基苷類抗生素的檢測方法及試劑盒，步驟如下；

其中完全抗原的制備：

步驟1??SM-BSA的合成，將EDC置于室溫下，放置2-3h；取10mg?BSA溶于1mL?MES緩沖液中，取20mg?SM溶于2.5mL?MES緩沖液中，兩溶液混合；取5mg?EDC溶于0.5mL滅菌蒸餾水中后，緩慢加入SM和BSA的混合溶液，室溫下反應5-7h，在4?℃冰箱中,用PBS0.01?moL/?L，pH?7.2,?透析4次，每次5-6?h，偶聯產物冷凍干燥保存備用，用于單克隆抗體的ELISA篩選；

步驟2??SM-OVA的合成，將EDC置于室溫下，放置2-3?h；取10mg?OVA溶于1mL?MES緩沖液中，取20mg?SM溶于2.5mL?MES緩沖液中，兩溶液混合；取5mg?EDC溶于0.5mL滅菌蒸餾水中后，緩慢加入SM和OVA的混合溶液，室溫下反應5-7h，在4?℃冰箱中,用PBS0.01?moL/?L，pH?7.2,?透析4次，每次5-6?h，偶聯產物冷凍干燥保存備用，用于Balb/c小鼠免疫；

其中單克隆雜交瘤細胞系的制備：

步驟1動物免疫，分別以SM-OVA免疫8周齡Balb/c?小鼠；首次免疫取200ulSM-OVA加入等量弗氏完全佐劑乳化抗原，多點皮下注射，初次免疫間隔21d，以后每隔14d，用150ulSM-OVA加入等量不完全佐劑充分乳化，加強免疫4?次，第4?次免疫3d后，尾靜脈采血，分離血清，測定效價；

步驟2?細胞融合，取免疫的BALB/c小鼠，采血，常規方法進行細胞融合，經HAT培養基篩選，期間視細胞生長情況，每3-5d換液一次，10d后改換HT培養液；

步驟3雜交瘤細胞克隆，待雜交瘤細胞長至孔底面積1/10以上時吸出上清供抗體檢測：將SM-BSA抗原分別以10?ug/ml濃度包被酶聯板，每孔用量100ul，4℃包被過夜，用PBST洗滌3min，拍干，5%BSA?37℃封閉2h，待檢細胞培養上清1:5倍稀釋后，取100?ul加入反應孔，37℃、反應1h，PBST洗滌4次，每次1min，拍干，用HRP標記抗鼠二抗1:10000倍稀釋后，每孔加入100?ul，37℃、反應40min，再用PBST洗滌4次，每次1min，拍干，每孔加入TMB底物溶液100?ul，37℃、反應15min，加入50?ul?2M?H₂SO₄即終止反應；陽性克隆采用有限稀釋法對抗體檢測陽性孔進行三輪克隆，獲陽性克隆后，擴大培養，并液氮凍存；

步驟4?抗體亞型鑒定，單克隆細胞培養液上清1:100倍稀釋后，按100ul/孔包被96孔酶標板?；采用Sigma公司小鼠單克隆抗體分型試劑盒，貨號098k4823，進行單克隆抗體亞型鑒定，每種抗體樣品重復3次；

步驟5單克隆腹水制備，8周齡Balb/c小鼠每只注射0.5ml降植烷，14-20d分別注射Pami-SP20交瘤細胞0.5ml，即為1×10⁷細胞/毫升；8-12?d收集腹水，離心純化經ELISA測定其效價；

步驟6?western-blot即蛋白質印跡檢測，參照分子克隆實驗指南，配制好反應液體，用BSA?、SM-BSA、SM-慶大霉素、SM-新霉素、SM-氨芐霉素、SM-卡那霉素、SM-大觀霉素、SM-強力霉素50微克/孔分別點樣，積層膠恒流10mA，分離膠恒流25mA電泳，電泳完畢后，電轉硝酸纖維素膜，?Pami-SP20-antibody單克隆抗體1：2000稀釋，進行western-blot反應，驗證單克隆抗體的反應特異性；

步驟7?Pami-SP20-antibody單克隆抗體的辣根過氧化物酶標記：稱取HRP25mg溶于1.25％戊二醛溶液中，于室溫靜置過夜；反應后的酶溶液經Sephadex?G-25層析柱，用生理鹽水洗脫，流速控制在1ml/1min，收集棕色流出液；待標記的抗體12.5mg用生理鹽水稀釋至5ml，攪拌下逐滴加入酶溶液中；用1M?pH9.5碳酸緩沖液0.25ml，繼續攪拌3h；加0.2M賴氨酸0.25ml，混勻后，置室溫2h；在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨，置4℃1h；3000rpm離心30min，棄上清，沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，最后沉淀物溶于3ml0.15M?pH7.4的PBS中；將上述溶液裝入透析袋中，用0.15M?pH7.4的PB緩沖鹽水透析，10,000rpm離心30min去除沉淀，上清液即為酶結合物，分裝后，冰凍保存。