[發明專利]海膽變態相關的SSR標記篩選方法

無效

• 申請號: 201110385925.9
• 申請日: 2011-11-29
• 公開（公告）號: CN102443637A
• 公開（公告）日: 2012-05-09
• 發明（設計）人: 秦艷杰;李霞;羅耀明;孫博林
• 申請（專利權）人: 大連海洋大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 大連非凡專利事務所 21220
• 代理人: 閃紅霞

技術領域

本發明涉及一種棘皮動物分子生物學領域，尤其是一種操作簡單，可快速提取海膽變態前后DNA的海膽變態相關的SSR標記篩選方法。

背景技術

隨著海膽養殖規模的不斷擴大，遺傳育種工作也正逐漸展開，其分子標記技術是進行標記輔助育種和遺傳結構分析的重要手段。由于海膽變態階段是海膽生命周期中非常脆弱、死亡率極高的階段，因此研究影響這一階段的遺傳學因素及分子機理十分必要。然而，由于海膽生長發育需經歷一個較長時間的幼蟲階段，幼蟲個體較小，DNA含量少，無法用常規的“酚——氯仿”法進行DNA抽提，以至于迄今為止對于海膽發育早期階段的分子標記研究依然空白。

發明內容

本發明是為了解決現有技術所存在的上述技術問題，提供一種操作簡單，可快速提取海膽變態前后DNA的海膽變態相關的SSR標記篩選方法。

本發明的技術解決方案是：一種海膽變態相關的SSR標記篩選方法，其特征在于按如下步驟進行：

a．固定

取若干海膽八腕幼蟲，用DMSO固定液固定，固定液體積至少為幼蟲體積的10倍，所述DMSO固定液的成分是15%DMSO、0.25mol/L?EDTA及飽和NaCl；4℃冰箱中保存；

取若干殼徑<1.0cm的稚膽，將稚膽個體置于濃度為75%酒精中固定；4℃冰箱中保存；

b.?裂解

取經固定液固定的海膽八腕幼蟲，經蒸餾水清洗后分離完整個體，再將每個個體分別置于0.2mlPCR管中，加入15ul裂解液A，所述裂解液A的成分是10mmol/L?pH8.0的Tris-HCl、50mmol/L?KC1、1%Tween-20及0.7ug/ul蛋白酶K；

取經酒精固定的稚膽個體，用蒸餾水反復沖洗，再將每個個體切口后分別置于其他0.2mlPCR管中，加入15ul裂解液B，所述裂解液B的成分是2.5mmol/L?pH8.0的Tris-?HCl、0.2mmol/L?EDTA及0.7ug/ul蛋白酶K；

將上述PCR管分別在55℃水浴恒溫3h后，升溫到85℃保持10min，冷卻到室溫后置于-20℃冰箱中保存備用；

c.?微衛星擴增

將所得海膽八腕幼蟲DNA裂解液和稚膽DNA裂解液分別作為微衛星擴增的模板進行擴增，每種模板擴增10?個SSR位點，位點名稱分別是INTS01、INTS02、INTS04、INTS10、INTS12、INTS14、INTS19、INTS20、ST16和ST24；微衛星擴增體系是：取所得的DNA裂解液1ul，10×buffer?2.5ul，SSR上下游引物（10uM）各1.0ul，dNTP（10mM）2.2ul，Mg²⁺（25mM）1.5ul，Taq酶?（5U/ul）0.35ul，ddH₂O?15.45ul作為PCR反應液；PCR反應程序為：94℃5分鐘；94℃1分鐘，退火溫度1分鐘，72℃40秒，30個循環；72℃10分鐘，之后4℃保存；

d.?變態相關位點篩選

利用X²檢驗的方法，篩選海膽變態前后出現顯著頻率差異的微衛星位點和等位基因。

本發明針對海膽幼蟲及稚膽階段個體小、DNA含量少的特點，采用固定液固定，用裂解液直接裂解法獲得海膽發育早期每個個體的DNA，用以進行微衛星擴增的模板，所得帶型清晰穩定，雜帶少，可篩選出海膽變態前后出現頻率差異的位點和等位基因，有助于揭示影響海膽變態的遺傳學背景和分子機制。

具體實施方式

按如下步驟進行：

a．固定

采用篩絹網濾取若干個中間球海膽八腕幼蟲，置于固定液中固定，固定液體積至少為幼蟲體積的10倍，所述固定液的成分是15%（體積百分比）DMSO、0.25mol/L?EDTA及飽和NaCl，即在容器中加入總體積15%的DMSO及0.25mol/L?EDTA后，再添加NaCl，直至NaCl飽和，4℃冰箱中可保存2個月；

取若干個殼徑<1.0cm的中間球海膽稚膽，直接用鑷子夾取稚膽個體置于濃度為75%酒精中固定，4℃冰箱保存。

b.?裂解