[發明專利]海膽變態相關的SSR標記篩選方法

無效

• 申請號: 201110385925.9
• 申請日: 2011-11-29
• 公開（公告）號: CN102443637A
• 公開（公告）日: 2012-05-09
• 發明（設計）人: 秦艷杰;李霞;羅耀明;孫博林
• 申請（專利權）人: 大連海洋大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 大連非凡專利事務所 21220
• 代理人: 閃紅霞

1.一種海膽變態相關的SSR標記篩選方法，其特征在于按如下步驟進行：

a．固定

取若干海膽八腕幼蟲，用DMSO固定液固定，固定液體積至少為幼蟲體積的10倍，所述DMSO固定液的成分是15%DMSO、0.25mol/L?EDTA及飽和NaCl；4℃冰箱中保存；

取若干殼徑<1.0cm的稚膽，將稚膽個體置于濃度為75%酒精中固定；4℃冰箱中保存；

b.?裂解

取經固定液固定的海膽八腕幼蟲，經蒸餾水清洗后分離完整個體，再將每個個體分別置于0.2mlPCR管中，加入15ul裂解液A，所述裂解液A的成分是10mmol/L?pH8.0的Tris-HCl、50mmol/L?KC1、1%Tween-20及0.7ug/ul蛋白酶K；

取經酒精固定的稚膽個體，用蒸餾水反復沖洗，再將每個個體切口后分別置于其0.2mlPCR管中，加入15ul裂解液B，所述裂解液B的成分是2.5mmol/L?pH8.0的Tris-?HCl、0.2mmol/L?EDTA及0.7ug/ul蛋白酶K；

將上述PCR管分別在55℃水浴恒溫3h后，升溫到85℃保持10min，冷卻到室溫后置于-20℃冰箱中保存備用；

c.?微衛星擴增

將所得海膽八腕幼蟲DNA裂解液和稚膽DNA裂解液分別作為微衛星擴增的模板進行擴增，每種模板擴增10?個SSR位點，位點名稱分別是INTS01、INTS02、INTS04、INTS10、INTS12、INTS14、INTS19、INTS20、ST16和ST24；微衛星擴增體系是：取所得的DNA裂解液1ul，10×buffer?2.5ul，SSR上下游引物（10uM）各1.0ul，dNTP（10mM）2.2ul，Mg²⁺（25mM）1.5ul，Taq酶?（5U/ul）0.35ul，ddH₂O?15.45ul作為PCR反應液；PCR反應程序為：94℃5分鐘；94℃1分鐘，退火溫度1分鐘，72℃40秒，30個循環；72℃10分鐘，之后4℃保存；

d.?變態相關位點篩選

利用X²檢驗的方法，篩選海膽變態前后出現顯著頻率差異的微衛星位點和等位基因。