[發明專利]一種從發酵液中提取多粘菌素B的方法

有效

• 申請號: 201110385129.5
• 申請日: 2011-11-25
• 公開（公告）號: CN103130875A
• 公開（公告）日: 2013-06-05
• 發明（設計）人: 張元欽;那可;趙文杰;趙波;程晴華
• 申請（專利權）人: 上海醫藥工業研究院;中國醫藥工業研究總院
• 主分類號: C07K7/62
• 分類號: C07K7/62;C07K1/36;C07K1/30;A61K38/12;A61P31/04
• 代理公司: 上海智信專利代理有限公司 31002
• 代理人: 朱水平;沈利

技術領域

本發明屬從生物中提取物質方法領域，特別涉及一種從多粘菌素B發酵液中提取多粘菌素B的方法。

背景技術

多粘菌素B是由多粘芽孢桿菌(Bacillus?polymyxa)在代謝過程中合成和分泌的具有良好抗菌活性的堿性環狀多肽，分子量約為1200Da；多粘菌素B在藥物上常用其硫酸鹽，分子量約為1300Da。目前在已知的抗生素中，多粘菌素對革蘭氏陰性菌的作用最強，特別是它能抑制由綠膿桿菌和大腸桿菌引起的各種感染，如腦膜炎、痢疾、呼吸系統感染、腹膜炎、膽管感染、尿路感染、燒傷感染、眼角膜感染及敗血癥等，且不易產生耐藥性。

多粘菌素B可由多粘芽孢桿菌經發酵生產所獲得的發酵液，經分離、提取、純化、干燥而得。在大規模生產過程中其分離、提取、純化制備一直是一個棘手的問題。至今，國內多粘菌素B的生產水平相對較低，還沒有企業正式投產，其原料藥基本從國外進口。多粘菌素B純品的效價為10000IU/g，市場上進口分裝的多粘菌素B效價≥6500IU/g，純度為60～80％左右。

目前多粘菌素B制備工藝主要為吸附分離法和樹脂分離法。

美國專利2695261^[1]公布了一種用吸附法從多粘芽孢桿菌的發酵液中提取多粘菌素A、B和E的方法。具體地公布了采用酸化、活性炭吸附、解吸以及干燥的方法，從發酵液中提取多粘菌素A、B和E。WIPO專利058427^[2]同樣采用吸附法，具體地公布了采用活性炭吸附、透析、有機溶劑沉降以及冷凍干燥的方法，從發酵液中提取多粘菌素B。這兩種工藝采用活性炭吸附，單步損失較大，且發酵液中的雜質容易造成活性炭的不可逆吸附，使活性炭難以再生重復使用；透析、凍干等操作對設備要求高，較萃取法耗時長，成本高，不適合工業化生產放大。

美國專利3132994^[3]公布了一種用樹脂分離法從多粘芽孢桿菌的發酵液中提取多粘菌素的方法。具體地公布了用離子交換樹脂吸附、洗脫以及調pH沉淀的方法從發酵液中提取多粘菌素。WIPO專利142611^[4]同樣用到了樹脂分離法，具體地公布了用活性炭脫色、樹脂吸附、洗脫以及沉淀的方法，從多粘芽孢桿菌的發酵液中提取多粘菌素B。這兩種工藝一次性投入較大，而且樹脂容易污染，需要再生處理。因此，樹脂分離法較萃取法操作更為繁瑣，而且制備的多粘菌素B純度較低。

發明內容

本發明的目的在于提供一種從多粘菌素B的發酵液中提取多粘菌素B的方法，以較高的收率制備得到高純度硫酸多粘菌素B。該方法操作簡便、耗時短、對設備要求低。

本發明的技術方案是：一種從多粘菌素B的發酵液中提取多粘菌素B的方法，包括以下步驟：

a.將多粘菌素B的發酵液固液分離，取濾液；

b.將步驟a所得的濾液用極性有機溶劑萃取，萃取液在pH1.0～2.0用水反萃；和

c.將步驟b所得的反萃液中加入反萃液體積3～8％(w/v)的無機鹽，并調整至pH?9.0～10.0，從而析出沉淀，即為多粘菌素B。

本發明中步驟a為：將多粘菌素B的發酵液經固液分離，取濾液。其中所述的多粘菌素B的發酵液是任何已知的含有多粘菌素B的菌體發酵液。一般是多粘芽孢桿菌發酵液。發酵液固液分離的方法是已知的任何方法，如過濾法、離心分離法、靜置沉淀法等。本發明優選過濾法。因為發酵液本身黏度較大，為了便于發酵液的大規模固液分離，優選的將發酵液經過預處理，再進行固液分離。所述的預處理優選包括調節發酵液pH至2.0～3.0，80～100℃加熱25～60分鐘。

本發明中步驟b為：將步驟a所得的濾液用極性有機溶劑進行萃取，然后將萃取液在pH1.0～2.0用水反萃。其中，萃取和反萃的方法都是常規方法。萃取所用的極性有機溶劑優先選自C4～C8的烷基醇和烷基醇與烷基酸所形成的C4～C8的酯。更佳的選自正丁醇、正丙醇、正戊醇、乙酸乙酯和乙酸丁酯，最優選正丁醇。極性有機溶劑在萃取時的加入量是常規的萃取體積，優選濾液體積的40～60％(體積百分比)。極性有機溶劑萃取較佳的在pH?11.0～12.5下進行。用水反萃時水的用量是常規的反萃用量，優選萃取液體積的90～110％(體積百分比)。

較佳的步驟b中極性有機溶劑萃取液在用水反萃前還經過了用水洗滌的步驟。用水洗滌的方法是常規的萃取液水洗方法，一般如加入水混合均勻后，棄水相即可。水洗對水的用量沒有要求。水洗可以反復進行多次。