[發(fā)明專利]水稻胡麻葉斑病原菌的分子鑒定方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110383736.8
• 申請(qǐng)日: 2011-11-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102399888A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-04-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 郭士偉;陳洪亮;彭陳
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及水稻胡麻葉斑病原菌的分子鑒定方法，具體地說(shuō)，是將胡麻葉斑病原菌從染病的水稻材料上分離和培養(yǎng)后提取DNA，利用分子生物學(xué)的方法進(jìn)行鑒定，屬于病原真菌鑒定技術(shù)領(lǐng)域。?

背景技術(shù)

水稻胡麻葉斑病是由半知菌的平臍蠕孢屬引起的一種真菌病害。從秧苗期到收獲期都可發(fā)病，稻株上各部位均易受害。葉片及葉鞘上的病斑多為芝麻粒狀，病斑中央為褐色至灰白色，邊緣褐色，周圍有深淺不同的黃色暈圈，嚴(yán)重時(shí)能相互結(jié)成不規(guī)則的大病斑。谷粒感病受害，病斑呈灰黑色，可擴(kuò)大及全粒，造成秕谷，嚴(yán)重的谷粒質(zhì)脆易碎，俗稱“茶米”。該病分布于世界各稻區(qū)，我國(guó)南北稻區(qū)均有發(fā)生。感病田塊，一般減產(chǎn)10-30％，嚴(yán)重者減產(chǎn)50％以上甚至絕收。孟加拉國(guó)曾因本病流行，稻谷失收而造成饑荒。通常認(rèn)為該病是由于缺乏肥、水等原因引起的。在我國(guó)，此病以前發(fā)生普遍而嚴(yán)重，成為國(guó)內(nèi)水稻三大病害之一。后來(lái)隨著水稻生產(chǎn)管理和施肥水平的不斷提高，其為害日益減輕。因此，近年來(lái)對(duì)該病很少有研究，研究資料比較缺乏。由于耕作方法和氣候的改變，該病在我國(guó)南北多個(gè)稻區(qū)近幾年又嚴(yán)重發(fā)生。因此，必需重新重視對(duì)胡麻葉斑病的研究。但目前還缺乏水稻胡麻葉斑病原菌的分離和鑒定方法，無(wú)法有效地開(kāi)展對(duì)水稻胡麻葉斑病的研究。同時(shí)，由于胡麻葉斑病和稻瘟病在病癥上非常相像，從發(fā)病形態(tài)上容易混淆這兩種病害，嚴(yán)重影響了該病害的防控。?

真核生物的核糖體包括大亞基60S與小亞基40S，大亞基60S由25-28SrRNA、5.8S?rRNA和5S?rRNA及核糖體蛋白構(gòu)成；小亞基40S則由18S?rRNA與相關(guān)核糖體蛋白構(gòu)成。5.8S、25S、18S之間的內(nèi)轉(zhuǎn)錄基因間隔序列為基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔序列(ITS)。因此，18S?rDNA是真核生物核糖體小亞基40S?rRNA基因群的一個(gè)轉(zhuǎn)錄原件，它既有保守區(qū)又有可變區(qū)，應(yīng)用分類范圍為界、門、綱、目、科、屬、種間，是系統(tǒng)發(fā)育中，種級(jí)以上的良好標(biāo)記，一般適應(yīng)于較高水平類群間的系統(tǒng)分析。ITS應(yīng)用分類范圍為屬、種間、種內(nèi)，廣泛適應(yīng)于較低分類階元。不同的真菌，其18S?rDNA和ITS序列和長(zhǎng)度都是不同的，如果能對(duì)胡麻葉斑病原菌的18S?rDNA和ITS進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增并測(cè)序，就可以通過(guò)比較待測(cè)真菌與胡麻葉斑病原菌18S?rDNA和ITS長(zhǎng)度和序列來(lái)判斷待測(cè)真菌是否屬于胡麻葉斑病原菌。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是解決胡麻葉斑病原菌的鑒定問(wèn)題，提供一種用分子生物學(xué)技術(shù)鑒定胡麻葉斑病原菌的方法。?

為達(dá)到本發(fā)明的目的，本發(fā)明人多次從發(fā)病田塊取樣感染胡麻葉斑病的水稻葉片，樣品均經(jīng)過(guò)植物病理學(xué)專家鑒定確認(rèn)。采用本發(fā)明的方法，從病原菌?中提取DNA，用設(shè)計(jì)的18S?rDNA和ITS引物通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增提取到的DNA模板，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示，18S?rDNA區(qū)序列長(zhǎng)度為1829bp，ITS區(qū)序列長(zhǎng)度為586bp，如圖1所示，具體序列見(jiàn)SEQ?ID?NO.1和SEQ?ID?NO.2。?

上述鑒定方法中，待鑒定真菌的基因組DNA提取采用氯化芐提取純化的方法，其步驟為：取真菌材料加入無(wú)菌研缽中，同時(shí)加入用pH9.0的0.15mol/L三羥氨基甲烷溶液7ml與pH8.0的0.05mol/L乙二胺四乙酸二鈉溶液8mL混合后定容至100mL配制而成的提取緩沖液，迅速?gòu)氐籽心セ靹颍⊙心ズ蟮囊后w加入無(wú)菌離心管中，再依次加入質(zhì)量百分比濃度為10％的十二烷基磺酸鈉溶液和氯化芐試劑，混勻，50℃水浴處理，加入等體積的pH5.2的3mol/L醋酸鈉溶液混勻，加入70-75％的乙醇洗滌沉淀，離心棄去乙醇，揮發(fā)干乙醇后用無(wú)菌水溶解，瓊脂糖凝膠電泳分析得到基因組DNA樣品。?

上述擴(kuò)增18S?rDNA和ITS片段的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)條件是。擴(kuò)增體系：?jiǎn)魏塑账峒?μl；緩沖液加6.25μl；引物加10μl；模板基因組DNA加1.5μl；聚合酶加2.5μl；加雙蒸水補(bǔ)足至50μl。擴(kuò)增條件：95℃變性5分鐘；94℃40秒，45℃40秒，72℃90秒，33個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5分鐘。4℃終止反應(yīng)并保存。?

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，有如下有益效果：?