[發(fā)明專利]一種結(jié)合態(tài)微囊藻毒素的檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110383133.8
• 申請(qǐng)日: 2011-11-25
• 公開（公告）號(hào): CN102507797A
• 公開（公告）日: 2012-06-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孫秀蘭;李雪;張銀志;周偉杰;鈕為民;劉萍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N30/02
• 分類號(hào): G01N30/02;G01N30/08
• 代理公司: 北京匯信合知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11335
• 代理人: 王秀麗

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種藻毒素的檢測(cè)方法，尤其涉及一種結(jié)合態(tài)微囊藻毒素的檢測(cè)方法。?

背景技術(shù)

近年來對(duì)游離態(tài)藻毒素的毒性與其對(duì)飲用水和水產(chǎn)品的毒害作用研究廣泛，但關(guān)于結(jié)合態(tài)藻毒素能否釋放出游離態(tài)藻毒素并依附于食物鏈對(duì)人體健康產(chǎn)生巨大危害的研究卻甚少。藻毒素進(jìn)入水產(chǎn)品生物體內(nèi)，會(huì)與谷胱甘肽、磷酸蛋白激酶PP1A、PP2A等發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，產(chǎn)生結(jié)合態(tài)藻毒素MC-肽。藻毒素進(jìn)入水產(chǎn)品形成的結(jié)合態(tài)藻毒素?zé)o法用甲醇等有機(jī)溶劑提取出來，從而影響了對(duì)水產(chǎn)品中藻毒素污染情況的準(zhǔn)確檢測(cè)。目前常用的檢測(cè)方法是酶聯(lián)免疫檢測(cè)和液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)，但這兩種檢測(cè)方法的樣品提取都是用有機(jī)溶劑，無法將結(jié)合態(tài)藻毒素提取出來，從而只能檢測(cè)出水產(chǎn)品中極少部分未形成結(jié)合態(tài)的游離藻毒素；唯一能檢測(cè)出水產(chǎn)品中藻毒素總量的MMPB法(2-甲基-3-甲氧基-4-苯基丁酸)存在過程復(fù)雜、結(jié)果差異性大的問題。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所解決的技術(shù)問題是提供一種結(jié)合態(tài)藻毒素的檢測(cè)方法。?

為了解決上述問題，采用如下技術(shù)方案：?

1)收集破碎后生物體組織的上清液，上清液分成兩份，其中一份添加蛋白酶處理，另一份為空白；?

2)步驟1)中兩種上清液分別經(jīng)過純化、濃縮，定容待測(cè)；?

3)采用液質(zhì)聯(lián)用的方法分別測(cè)定步驟2)中樣品的藻毒素含量；?

4)酶法處理后樣品中藻毒素含量減去空白樣品中藻毒素含量得到結(jié)合態(tài)藻毒素的含量。?

所述蛋白酶，優(yōu)選胃蛋白酶和胰蛋白酶組成的酶液。?

步驟1)所述方法，具體為：稱取鯽魚肌肉組織鮮樣，于玻璃勻漿器勻漿后添加10ml?20％甲醇溶液于下超聲破碎5min，超聲破碎儀功率設(shè)置為75％，然后在12000r/min下離心10min，移取上清液至干凈容器中避光保存，再重復(fù)提取兩次，合并得溶液，置于50ml離心管中；將其中一份作為空白置于22攝氏度下避光保存8h，另一份樣品中添加10ml含胃蛋白酶和胰蛋白酶的碳酸鉀溶液(pH10.0)，每毫升碳酸鉀溶液中包含5mg胃蛋白酶和5mg胰蛋白酶，處理后同樣置于22攝氏度下避光保存8h。?

步驟2)所述方法，具體為：將兩份樣品溶液加入已預(yù)先活化的強(qiáng)陽離子交換固相萃取柱C18(6ml/500mg)中進(jìn)行富集，待富集完畢后，用20％的甲醇淋洗，最后用5ml100％色譜甲醇溶液洗脫，洗脫液收集于圓底燒瓶中，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸發(fā)至1ml，定容待測(cè)。?

步驟3)所述方法，具體條件如下：?

色譜條件檢測(cè)器：WATERS?ACQUITY?PDA，分析柱BEH?C18C182.1X100mm1.7um，柱溫45℃；流動(dòng)相：甲醇檢測(cè)波長：254nm；流速：0.3ml/min進(jìn)樣體積：5μL。?

質(zhì)譜條件掃描模式：正離子和負(fù)離子毛細(xì)管電壓：3.5kVolts錐孔電壓：45Volts離子源溫度：100℃脫溶劑氣溫度：300℃碰撞能量：6Volts質(zhì)量范圍：50-2000m/z。脫溶劑氣體流量：500lit/hr，鞘氣流速：50lit/hr。?

通過上述的液質(zhì)聯(lián)用的方法利用峰面積及標(biāo)曲，計(jì)算出樣品中所含藻毒素的量，即樣品的出峰面積＝5.6684×樣品中藻毒素的濃度+0.2113。?

結(jié)合態(tài)藻毒素的量可通過計(jì)算得到，酶法處理后樣品中藻毒素含量減去空白樣品中藻毒素含量得到結(jié)合態(tài)藻毒素的含量，還可以根據(jù)上述方法推算出水產(chǎn)品中藻毒素的總量和游離量。?

本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：?

1、利用液質(zhì)聯(lián)用法檢測(cè)被處理的樣品中游離藻毒素的含量變化，從而可用常規(guī)方法生物組織中結(jié)合態(tài)藻毒素的含量有直觀而準(zhǔn)確的認(rèn)識(shí)，其他的方法因沒有進(jìn)行此步處理無法真實(shí)的反應(yīng)生物組織中藻毒素的總量；?

2、用常規(guī)的試劑和條件處理樣品，簡(jiǎn)單易行，結(jié)果可靠，重現(xiàn)性好，靈敏度高。?

附圖說明

圖1：游離藻毒素的標(biāo)曲圖(1-32ug/L的MC-LR標(biāo)準(zhǔn)品溶液的質(zhì)譜圖)?

圖2：毒素灌喂組鯽魚肌肉組織中游離藻毒素檢出量隨不同處理手段發(fā)生的變化(a未經(jīng)處理的鯽魚肌肉中游離藻毒素的出峰圖，b高溫處理后鯽魚肌肉中游離藻毒素的出峰圖，c胃蛋白酶和胰蛋白酶處理后鯽魚肌肉中游離藻毒素的出峰圖，d高溫和胃蛋白酶和胰蛋白酶共同處理后鯽魚肌肉中游離藻毒素的出峰圖)?

圖3：太湖四種常見水產(chǎn)品經(jīng)不同手段處理后微囊藻毒素檢出量比較圖?

具體實(shí)施方式