[發明專利]核酸內切酶DUF820-1的原核表達與制備方法及應用

無效

• 申請號: 201110382899.4
• 申請日: 2011-11-25
• 公開（公告）號: CN102492705A
• 公開（公告）日: 2012-06-13
• 發明（設計）人: 韓家淮;徐虹;黃晶;吳娟
• 申請（專利權）人: 廈門大學
• 主分類號: C12N15/55
• 分類號: C12N15/55;C12N15/10;C12N15/70;C12N15/66;C12N9/22;C12Q1/68;C12Q1/44;C12R1/89;C12R1/19
• 代理公司: 廈門南強之路專利事務所 35200
• 代理人: 馬應森

技術領域

本發明涉及核酸內切酶，尤其是涉及一種能在30～64℃溫度范圍內酶切消化DNA的核酸內切酶DUF820-1的原核表達與制備方法及應用。

背景技術

核酸內切酶(endonuclease)是在核酸水解酶中，水解DNA分子鏈內部磷酸二酯鍵生成寡/寡聚核苷酸的酶。從對底物的特異性來看，可分為DNase?I、DNase?II等僅分解DNA的酶；脾臟RNase、RNaseT1等僅分解RNA的酶；還有就是如鏈孢霉(Neurospora)核酸酶這類既分解DNA又分解RNA的酶。一般來說，核酸內切酶大都不具堿基特異性，這類酶一般被用于去除溶液中的DNA或RNA。但也有諸如HindIII、EcoR?I等具有限制性的，能夠識別并切斷特定的堿基或堿基序列的酶，這類酶稱為限制性核酸內切酶，主要用于基因工程中基因的克隆和重組。([1].Simon?M。Emergent?computation：Emphasizing?Bioinformatics，Springer，Appendix，pp.375-390；[2].Madigan?MT，Martinko?JM，Brock?TD?et?al.Biology?of?Microorganisms.12th?ed.San?Francisco，CA：Pearson/Benjamin?Cummings，2009.Print.p.314)。核酸內切酶酶切反應的溫度一般在20～40℃，通常最適溫度為37℃，當低于37℃或略高于37℃時，雖然大部份酶仍具有活性，但是活性已大大降低。目前已發現的核酸內切酶中大多數酶都易被熱失活，用60～65℃熱處理10～15min即可使酶活性完全喪失，酶切反應終止。目前市售的非特異性的核酸內切酶為DNaseI，該酶被廣泛應用于制備不含DNA的RNA樣品、足跡法分析DNA-蛋白質相互作用和產生DNA隨機片段文庫。但是該酶并不能酶切所有生物體的染色體DNA，如螺旋藻等某些藍藻染色體DNA出于自我保護而被高度甲基化修飾，因而不易被DNaseI和大多數限制性內切酶所消化，所以這類生物體在制備DNA片段文庫時往往存在困難([3]Lambert?GR，Carr?N.Resistance?of?DNA?from?filamentous?and?unicellular?cyanobacteria?to?restriction?endonuclease?cleavage.Biochimica?Biophysica?Acta，1984，78(1-2)：45-55；[4]徐虹，柯珍戀，章軍。螺旋藻系統分類學與基因工程研究進展.海洋科學，2001，25(9)：26-28)藍藻DNA雖然不易被核酸內切酶消化但是其細胞內往往具有多種高活性的核酸內切酶，這些內切酶對多種生物種屬來源的染色體DNA都能發揮酶切功能。([5]Cao?J，Xu?Z，Qiu?G，Li?B.Effects?of?Mg²⁺?on?the?growth?and?Dnase?activity?of?Spirulina?platensis，a?cyanobacterium.Bioresource?Technol.1999，67(3)：287-290；[6]Lyra?C，Halme?T，Torsti?AM?et?al.Site-specific?restriction?endonucleases?in?cyanobacteria.J?Appl?Microbiol，2000，89(6)：979-991；[7]Sundararajan?V，?Bheemanaik?S，Anand?N.Nicking?endonuclease?in?cyanobacterium.Recent?research?in?Science?and?Technology，2010，2(10)：63-65；[8]Tragut?V，Xiao?J，Bulina?EJ，Borthakur?D，Characterization?of?DNA?restriction-modification?systems?in?Spirulina?platensis?strain?pacifica.Journal?of?Applied?Phycology，1995，7：561-564；[9]Saravanan?M，Elango?K，Chandrashekaran?S?et?al.A?new?typeII?restriction?endonuclease，OfoI?from?nonheterocystous?cyanobacterium?Oscillatoria?foreaui.Curr.?Sci，2003，85(2)：188-191)。為了獲得新的核酸內切酶，用于酶切不易被市售核酸內切酶消化的染色體DNA，我們對多種藍藻的基因組進行了分析，預測了一些可能具有核酸內切酶活性的蛋白，并分別對它們進行了克隆、表達和活性檢測，雖然它們中的大多數蛋白都具有核酸酶活性，但是能酶切諸如螺旋藻等藍藻這類被高度修飾的染色體DNA的蛋白卻不多。其中本發明從Microcystis?aeruginosaPCC7806中克隆表達的DUF820-1蛋白具有較強的核酸內切酶活性，能在廣泛的溫度范圍內對環狀質粒DNA和某些難于被市售核酸內切酶消化的染色體DNA進行酶切，因而可以被廣泛應用于制備不含DNA的RNA樣品，在RT-PCR前除去基因組DNA，為鳥槍法測序制作DNA文庫，用于足跡法分析DNA-蛋白質相互作用，與DNA?Polymerase?I一起用于切口平移，產生DNA隨機片段文庫，細胞凋亡TUNEL檢測中部分剪切基因組DNA作為陽性對照等等，具有廣闊的應用前景。