[發明專利]核酸內切酶DUF820-1的原核表達與制備方法及應用

無效

• 申請號: 201110382899.4
• 申請日: 2011-11-25
• 公開（公告）號: CN102492705A
• 公開（公告）日: 2012-06-13
• 發明（設計）人: 韓家淮;徐虹;黃晶;吳娟
• 申請（專利權）人: 廈門大學
• 主分類號: C12N15/55
• 分類號: C12N15/55;C12N15/10;C12N15/70;C12N15/66;C12N9/22;C12Q1/68;C12Q1/44;C12R1/89;C12R1/19
• 代理公司: 廈門南強之路專利事務所 35200
• 代理人: 馬應森

1.核酸內切酶DUF820-1基因的克隆和表達載體的構建方法，其特征在于包括以下步驟：

1)根據核酸內切酶的保守基序對銅綠微囊藻Microcystis?aeruginosa?PCC7806基因組序列進行保守結構域掃描，尋找具有核酸內切酶保守基序的蛋白，并對具有核酸內切酶保守基序的蛋白的序列進行分析；得到屬于DUF820超家族的3個功能未知蛋白具有核酸內切酶的保守結構域，將這3個蛋白分別命名為DUF820-1、DUF820-2和DUF820-3；所述DUF820-1蛋白含194個氨基酸，分子量為22.84KD，在GenBank中的登陸號為CAO87581.1，其編碼基因的登陸號為AM778948.1，基因位置標簽為IPF_2243，其基因序列見附錄序列表中第1個序列，氨基酸序列見附錄序列表中第2個序列；

2)DUF820-1基因的擴增，具體方法如下：

根據DUF820-1的基因序列設計合成如下兩條引物P1和P2：

P1：5’-CCGGATCC?CATATGCTAACTCGATCTCC-3’

P2：5’-CCGAATTCTTAGGATTTGAGATTAAAATC-3’

以銅綠微囊藻Microcystis?aeruginosa?PCC?7806的染色體DNA為模板，P1和P2為引物進行PCR擴增，取擴增產物進行0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果表明，擴增產物大小為580bp左右，與預期大小相吻合；

3)表達載體pET-DUF820-1的構建，具體方法如下：

將載體pET-His和步驟2)中的擴增產物分別用BamH?I和EcoR?I雙酶切，酶切產物經0.8％瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收，然后將回收產物用T₄DNA連接酶連接，連接產物轉化大腸桿菌，以Amp抗性篩選，獲得重組載體pET-DUF820-1。

2.核酸內切酶DUF820-1蛋白的表達和純化方法，其特征在于其具體步驟為：

將鑒定正確的表達載體pET-DUF820-1轉化大腸桿菌BL21，并挑單克隆到液體LB培養基中進行搖培，當培養液OD₆₀₀達到0.6時，添加IPTG在28℃過夜誘導培養轉化菌，離心收集過夜培養的菌體，在冰浴條件下，超聲破碎菌細胞，離心分離上清和沉淀，并通過SDS-PAGE電泳分析DUF820-1的表達，SDS-PAGE分析得到，目的蛋白可在大腸桿菌BL21中以包涵體形式大量表達，也有一部分目的蛋白以可溶形式表達，離心收集pET-His-DUF820-1轉化菌體，并重懸于結合緩沖液中進行超聲破碎，破碎后菌液離心取上清液過Ni-NTA柱，收集流出液；以8倍柱床體積漂洗緩沖液洗柱，收集漂洗組分；3倍柱床體積的洗脫緩沖液洗脫并收集目的蛋白DUF820-1；將過柱純化過的蛋白緩慢裝入透析袋中，用夾子夾緊放到酶儲存液中，4℃緩慢搖晃24h，期間更換4～5次新的酶儲存液，收集透析過夜的蛋白，此即為酶液。