[發明專利]一種吸附無細胞百白破聯合疫苗的制備方法

無效

• 申請號: 201110382612.8
• 申請日: 2011-11-25
• 公開（公告）號: CN102526717A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 侯文禮;廖常茹;馮曉;趙志鵬;鐘澤榮
• 申請（專利權）人: 成都康華生物制品有限公司
• 主分類號: A61K39/116
• 分類號: A61K39/116;A61P31/04;A61K39/05;A61K39/08;A61K39/10
• 代理公司: 四川省成都市天策商標專利事務所 51213
• 代理人: 劉興亮

1.一種制備吸附無細胞百白破聯合疫苗的方法，其通過將制備所得到的百日咳原液與精致純化得到的白喉類毒素和破傷風毒素混合最終制備得到可用于預防百日咳、白喉、破傷風三種疾病的無細胞百白破聯合疫苗，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

(1)采用包括戊二醛解毒步驟的方法來制備包含有效抗原PT和FHA的無細胞百日咳原液，其中戊二醛解毒是將梯度離心后的中間品用PBS稀釋為50μgPN/ml，然后加入戊二醛使其最終濃度為0.5％，置于20℃脫毒，每1小時振搖一次，然后加入賴氨酸溶液，使其最終濃度為0.2％，置于20℃作用3小時；

(2)采用包括甲醛解毒步驟的方法來制備白喉類毒素和破傷風毒素，其中制備白喉類毒素時甲醛解毒的具體操作條件為選擇0.5％的甲醛，經調pH至7.0～7.2，在37～39℃下脫毒，然后加入賴氨酸(9.125％)，脫毒42天左右；制備破傷風毒素時甲醛解毒的具體操作條件為甲醛0.15％，放置于37℃溫箱中加溫脫毒25天。

2.權利要求1所述的制備吸附無細胞百白破聯合疫苗的方法，其特征在于用于制備百日咳原液的菌種為百日咳I相菌種58003(CS)。

3.權利要求1所述的制備吸附無細胞百白破聯合疫苗的方法，其特征在于百日咳I相菌種58003(CS)的接種發酵罐培養條件為：將配制好SSM培養基加入10L發酵罐，接種細菌的培養濃度為3.0×10⁸/ml，培養溫度為37℃，通氣量40～60L/min，壓力0.1kg/cm²，攪拌器的轉速設定為350rpm。

4.權利要求1所述的制備吸附無細胞百白破聯合疫苗的方法，其特征在于制備無細胞百日咳原液的方法還包括硫酸銨鹽析、密度梯度離心步驟。

5.權利要求4所述的制備吸附無細胞百白破聯合疫苗的方法，其特征在于制備無細胞百日咳原液的硫酸銨鹽析是二次鹽析。

6.權利要求5所述的制備吸附無細胞百白破聯合疫苗的方法，其特征在于硫酸銨鹽析的具體操作條件如下：收集培養物并加入低濃度的硫酸銨進行一次鹽析，7日后經3500rpm離心40分鐘，棄上清，沉淀中加入PBS進行一次浸提，每天攪拌2次，每次40分鐘，經7000rpm離心60分鐘棄沉淀、上清液中加高濃度的硫酸銨二次鹽析、經9000rpm離心60分鐘，收集沉淀加入PBS二次浸提3天，每天攪拌2次，每次1小時，包袋透析，銨根檢測合格后，透析內液經16000rpm離心3小時后收取上層清液。

7.權利要求4所述的制備吸附無細胞百白破聯合疫苗的方法，其特征在于制備無細胞百日咳原液的密度梯度離心是經30000rpm蔗糖密度梯度離心18～20小時除去內毒素，收集糖濃度為4％～12％之間的樣品。

8.權利要求1所述的制備吸附無細胞百白破聯合疫苗的方法，其特征在于在制備無細胞百日咳原液時，進行戊二醛脫毒后，將所得原液包透析袋，每袋200～300ml，置于2～8℃，透析7日，進行戊二醛殘量檢測。

9.權利要求1所述的制備吸附無細胞百白破聯合疫苗的方法，其特征在于制備得到的百日咳原液、白喉類毒素和破傷風毒素后，配置13mg/ml的氫氧化鋁，高壓滅菌，將氫氧化鋁用生理鹽水稀釋至24mg/ml，將百日咳原液、精制白喉和破傷風類毒素加入氫氧化鋁，于20-25℃攪拌吸附4小時。

10.權利要求9所述的方法制備得到的吸附無細胞百白破聯合疫苗，其特征在于：獲得百日咳有效抗原PT和FHA，經過檢測這兩種有效抗原的純度達到85％以上，且含無細胞百日咳疫苗效價應不低于4.0IU，白喉疫苗效價應不低于30IU，破傷風疫苗效價應不低于40IU。