[發明專利]5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶抗體的免疫原及其制備方法與應用

無效

• 申請號: 201110378381.3
• 申請日: 2011-11-24
• 公開（公告）號: CN102492671A
• 公開（公告）日: 2012-06-13
• 發明（設計）人: 王保民;譚桂玉;南鐵貴;趙洪偉;高巍;王敏;孫碩;曹振
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C07K16/40;G01N33/573
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;任鳳華

技術領域

本發明涉及5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶抗體的免疫原及其制備方法與應用。

背景技術

莽草酸途徑是植物和微生物芳香族氨基酸合成的重要途徑。5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)是莽草酸途徑的關鍵酶。近年來，由于除草劑草甘膦的廣泛使用，及其非選擇性的特點，促使克隆草甘膦抗性基因、培育抗草甘膦基因作物成為熱點。CP4-EPSPS作為該類備選基因，已成功應用于多種商業化抗草甘膦轉基因作物。

中國政府對轉基因作物的安全性極為關注，并制定了有關法規。但由于我們目前未開展轉基因抗除草劑草甘膦方面的研究，也沒有建立對國外進口植物是否為轉基因抗除草劑商品進行檢測的體系，所以還待開發轉基因EPSPS蛋白的檢測方法。免疫檢測技術已被廣泛應用于毒素、殺蟲劑、炸藥等的環境污染和危險物的檢測，與其他檢測系統相比，免疫檢測方法具有快速、廉價、簡便、靈敏和特異的優點，可便攜進行現場檢測。免疫檢測試劑盒可以快速檢測某一特定物質的含量，但要將免疫分析法應用到檢測轉基因EPSPS蛋白，必須制備相應的抗原和抗體。

發明內容

本發明的一個目的是提供一種制備5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶抗體的免疫原的方法。

本發明所提供的制備5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶抗體的免疫原的方法，包括如下步驟：

(1)將載體蛋白與雙功能試劑進行反應，得到反應產物I；所述雙功能試劑選自4-馬來酰亞胺基丁酸-N-琥珀酰亞胺酯、琥珀酰亞胺基4-[p-馬來酰亞胺苯基]丁酸鹽或N-[ε-馬來酰亞胺乙酰基氧]硫代琥珀酰亞胺酯；

(2)將所述步驟(1)得到的反應產物I與序列表中序列1所示的多肽進行反應，得到反應產物II，即得到5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶抗體的免疫原。

所述步驟(1)中所述載體蛋白與所述雙功能試劑的投料摩爾比為1∶10-1∶20或1∶10或1∶15或1∶20；

所述步驟(2)中所述反應產物I與所述多肽的投料摩爾比為1∶10-1∶20或1∶10或1∶15或1∶20。

所述步驟(1)中所述反應的溫度為20℃-25℃或20℃或23℃或25℃，所述反應的時間為1h-3h或1h或2h或3h。

所述步驟(2)中所述反應的溫度為20℃-25℃或20℃或23℃或25℃，所述反應的時間為10h-20h或10h或15h或20h。

所述步驟(1)中所述載體蛋白為牛血清白蛋白或卵清白蛋白。

所述步驟(1)中在得到所述反應產物I之后，還包括以下步驟：

將所述反應產物I進行凝膠過濾層析，用0.01M?PH7.5磷酸鹽緩沖液進行洗脫，收集OD₂₇₈為1.5-3.0的洗脫液，即得到純化的反應產物I；所述凝膠過濾層析的介質為Sephadex?G-25。

所述步驟(2)中還包括將所述反應產物II進行透析，得到純化的反應產物II的步驟。

根據所述方法制備得到的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶抗體的免疫原也屬于本發明的保護范圍。

由所述5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶抗體的免疫原制備得到的抗體也屬于本發明的保護范圍。

所述5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶抗體的免疫原和/或所述抗體在鑒別轉5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因植物中的應用也屬于本發明的保護范圍。

本發明所提供的制備EPSPS多肽抗原的方法能夠方便、快捷地獲得EPSPS多肽抗原，且合成步驟簡潔明了、合成成本低，效果好。用本發明方法制備的EPSPS多肽抗原進行免疫得到的抗體的特異性好、最低檢測限值低。因此，本發明所提供的制備EPSPS多肽抗原的方法以及由該方法獲得的EPSPS多肽抗原，將在EPSPS蛋白的酶聯免疫檢測中有廣闊的應用前景。

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。