[發明專利]人胸腺素β4二串體蛋白的制備方法

有效

• 申請號: 201110376361.2
• 申請日: 2011-11-24
• 公開（公告）號: CN102533911A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 張英起;徐天嬌;李萌;張偉;王增祿
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第四軍醫大學
• 主分類號: C12P21/02
• 分類號: C12P21/02;C07K1/20;C12R1/19
• 代理公司: 北京鼎佳達知識產權代理事務所(普通合伙) 11348
• 代理人: 蔣常雪

技術領域

本發明屬于醫藥生物技術領域，具體涉及重組人胸腺素β4二串體目的蛋白的制備工藝。

背景技術

胸腺素β4是由43個氨基酸殘基組成的多肽，在哺乳動物中高度保守。與胸腺素原或類胸腺素不同，胸腺素β4是胞漿蛋白而非核蛋白，并且它只含有較少的疏水性氨基酸，不含有Lys-Lys-Xaa-Lys結構區域。其氨基酸序列如下：AcSDKPDMAEIEKFDKSKLKKTETQEKNPLPSKETIEQEKQAGES。胸腺素β4廣泛分布于各組織、器官和細胞中，與免疫功能、神經發育和肌動蛋白功能密切，還可抗炎，促進血管生成、創傷愈合、毛囊發育，修復受損的心肌。

雖然胸腺素β4有著廣泛的應用前景，但由于其分子太小，難于直接在大腸桿菌中表達。目前用于實驗室及臨床試驗的胸腺素β4多為化學合成品，價格昂貴；而從哺乳動物組織中提取Tβ4，過程復雜而且產量較低，使其應用受到限制，如何以更經濟的方法獲取此多肽顯得非常重要。

Tsuji?Y等用大腸桿菌高效表達了胸腺素β4與TNF構成的嵌合體蛋白，在適當的酸性環境中將二者之間的Asp-Pro橋切開，胸腺素β4從嵌合體蛋白中釋放，經過純化便可得到較多的胸腺素β4蛋白。

陳妍柯等將胸腺素β4基因片段克隆入質粒pLDH4的EcoR?V和Hind?III位點之間，重組表達質粒轉化大腸桿菌DH5，誘導后的目的蛋白經硫酸銨鹽析技術、Source?RPC反相層析柱和Q?Sepharose?HP陰離子交換柱純化，得到的N端融合5個氨基酸(HKCDI)，可提高E-玫瑰花環結花率并能夠促進淋巴細胞的增殖和分化。

賈琪等構建重組表達質粒pET28a(+)-Tβ4，將其轉化大腸桿菌BL21，經IPTG誘導后表達帶6×His標簽的融合蛋白，并經鎳柱一步親和層析即獲得純化，CAM試驗證明His₆-Tβ4蛋白有促進毛細血管生成的活性。

XK?Li等構建重組表達質粒pTXB-Tβ4，將其轉化大腸桿菌ER?2566，IPTG誘導得到的融合蛋白經一步親和純化、DTT自動水解后，得到的胸腺素β4C端融合5個氨基酸(LEGSS)，不僅可以促進淋巴細胞的增殖和分化，而且可以促進傷口愈合。

發明內容

本發明的目的是提供一種人胸腺素β4二串體蛋白的制備方法，本發明的制備方法步驟簡單，快速可靠，成本低，僅僅使用了一個層析柱就完成了純化過程，且純度達到98％以上。此方法制備的人胸腺素β4二串體蛋白具有生物學活性，促進HUVECs(人臍靜脈內皮細胞)的增殖、遷移，活性優于化學合成的單體。

在本發明的詳述之前，應當將一些常用術語進行限定和解釋，如下：

所用的術語“人胸腺素β4以二串體蛋白”意指將無法在大腸桿菌中直接表達的人胸腺素β4以二串體的形式在大腸桿菌中高效表達，利用大腸桿菌偏愛密碼子，合成人胸腺素β4全長基因，結合PCR技術構建了人胸腺素β4二串體基因表達載體pET-22b(+)-Tβ4②，重組質粒轉化大腸桿菌BL21感受態細胞，IPTG誘導表達得到人胸腺素β4二串體蛋白。其DNA序列為：CATATG?AGT?GAT?AAA?CCG?GAT?ATG?GCC?GAG?ATT?GAG?AAA?TTT?GATAAG?TCA?AAA?TTG?AAG?AAA?ACG?GAA?ACT?CAG?GAA?AAG?AAC?CCG?TTGCCT?TCA?AAA?GAG?ACC?ATC?GAA?CAG?GAA?AAG?CAG?GCG?GGG?GAA?AGCGGATCC?AGT?GAT?AAA?CCG?GAT?ATG?GCC?GAG?ATT?GAG?AAA?TTT?GATAAG?TCA?AAA?TTG?AAG?AAA?ACG?GAA?ACC?CAG?GAA?AAG?AAC?CCG?TTGCCT?TCA?AAA?GAG?ACC?ATC?GAA?CAG?GAA?AAG?CAG?GCG?GGG?GAA?AGCTAG?GTCGAC。

劃線部分分別為Nde?I、BamH?I和SalI酶切點。