[發(fā)明專利]致瀉大腸桿菌四重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110376158.5
• 申請(qǐng)日: 2011-11-23
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102399884A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-04-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳瑜;陳曉;鄭書(shū)發(fā);孔海深
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12Q1/10;C12Q1/06;G01N21/64
• 代理公司: 杭州求是專利事務(wù)所有限公司 33200
• 代理人: 張法高;趙杭麗

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種四重實(shí)時(shí)熒光定量PCR在同一個(gè)反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)檢測(cè)胃腸炎腹瀉患者的糞便標(biāo)本中致瀉性大腸桿菌O157：H7、O104：H4血清型的核酸檢測(cè)方法，可應(yīng)用于致瀉性大腸桿菌引起暴發(fā)疫情的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)急檢測(cè)。

背景技術(shù)

引起腹瀉的大腸桿菌稱為致瀉性大腸桿菌，根據(jù)毒力因子、致病機(jī)理和流行病學(xué)特征，通常將致瀉性大腸桿菌分為5?類，分別為腸致病性大腸桿菌（EPEC）、腸產(chǎn)毒性大腸桿菌（ETEC）、腸侵襲性大腸桿菌（EIEC）、腸集聚性大腸桿菌（EAEC）以及腸出血性大腸桿菌（EHEC）。EHEC感染后，患者往往會(huì)出現(xiàn)：出血性腸炎，表現(xiàn)為腹瀉（血便，鮮血樣）、腹痛和溶血性尿毒綜合征（HUS）。HUS表現(xiàn)為腎功能衰竭、溶血性貧血、血小板減少、血栓性血小板減少紫癜（TTP），可因腎衰和多臟器受損而死亡，死亡率達(dá)3%-5%，近30%的患者會(huì)留下嚴(yán)重的后遺癥。O157:H7是EHEC的主要血清型，?1999年我國(guó)蘇皖等地暴發(fā)了大腸桿菌O157:H7感染性腹瀉，估計(jì)2萬(wàn)人感染。2011年德國(guó)暴發(fā)的疫情是由EHEC?O104：H4血清型引起，死亡病例24例，其中女性15例。除德國(guó)外，奧地利、捷克、丹麥、法國(guó)、荷蘭、挪威、西班牙、瑞典、瑞士、英國(guó)、盧森堡、美國(guó)、加拿大等15個(gè)國(guó)家也報(bào)告了輸入性EHEC感染病例，部分發(fā)展為溶血性尿毒綜合征。

鑒于致瀉性大腸桿菌在公共衛(wèi)生中的重要性與日俱增，因而在胃腸炎和食物中毒監(jiān)測(cè)中要進(jìn)行多種腹瀉細(xì)菌的檢測(cè)，不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力而且浪費(fèi)臨床標(biāo)本與試劑。常規(guī)檢測(cè)以傳統(tǒng)培養(yǎng)方法為主，不僅操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)、而且容易污染。因此，建立一種能夠快速檢測(cè)出致瀉性大腸桿菌的技術(shù)對(duì)我國(guó)應(yīng)對(duì)潛在的致瀉性大腸桿菌疫情具有重要的意義。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展及其在醫(yī)學(xué)研究中的廣泛應(yīng)用，特別是最近幾年興起的熒光定量PCR技術(shù)，該方法具有準(zhǔn)確性高、重現(xiàn)性好等特點(diǎn)，已廣泛用于基因表達(dá)研究、病原體檢測(cè)、SNP分析及基因分型等諸多領(lǐng)域。該方法采用完全閉管檢測(cè)，省去了對(duì)PCR產(chǎn)物后處理，避免了交叉污染，結(jié)果判斷由計(jì)算機(jī)完成，簡(jiǎn)化了操作步驟，并加強(qiáng)了結(jié)果的可靠性。隨著熒光定量技術(shù)、儀器以及材料科學(xué)的發(fā)展，熒光定量技術(shù)不僅僅在定量上發(fā)揮它的優(yōu)勢(shì)，而且運(yùn)用TaqMan或TaqMan－MGB探針的5`末端標(biāo)記上不同的熒光染料（FAM、HEX等）技術(shù)可以進(jìn)行基因分型、基因突變檢測(cè)和SNP分析等方面研究。因此，建立關(guān)于O104：H4和O157：H7致瀉性大腸桿菌的多重?zé)晒舛縋CR的快速、準(zhǔn)確、靈敏、特異的基因診斷分子生物學(xué)方法與診斷試劑盒尤為重要。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種針對(duì)致瀉大腸桿菌O157：H7、O104：H4四重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。該試劑盒由熒光定量PCR反應(yīng)液、O157標(biāo)準(zhǔn)品、H7標(biāo)準(zhǔn)品、O104標(biāo)準(zhǔn)品、H4標(biāo)準(zhǔn)品、對(duì)照品組成，其中熒光定量PCR反應(yīng)液包含有PCR反應(yīng)緩沖液（含氯化鎂和三磷酸脫氧核糖核苷酸混合物、耐熱Taq?DNA聚合酶等）、特異性上下游引物和探針，其中特異性上下游引物、特異性探針和基因標(biāo)準(zhǔn)品序列分別如下：?

O157上游引物-F:?5’-?TGGCATGACGTTATAGGCTACAAT?-3’

O157下游引物-R:?5’-?AGCTTGTTCTAACTGGGCTAATCCT?-3’

O157特異性探針-P:?5’-?FAM-ATAGGATGACAAATATCTGCGCTGCT-BHQ1-3’

H7上游引物-F:?5’-GGCGCAGGCTGCTGATT?-3’

H7下游引物-R:?5’-AGCTTCAAAACGTGATGCGTTAGCTG?-3’

H7特異性探針-P:?5’-?HEX-CAGATTTACCCACATCAGCATG?-BHQ1-3’

O104上游引物-F:?5’-?AGGAGTAAACAATGTCAAAGCAAC?-3’???

O104下游引物-R:?5’-?AAAATCCTTTAAACTATACGCCC-3’?????

O104特異性探針-P?:?5’-?ROX-ACTTGGTTTTTTTGTATTAGCAATAAGTGGTG-BHQ2-3’

H4上游引物-F:?5’-?GCTGGGGGTAAACAAGTCAA?-3’???

H4下游引物-R:?5’-?CAGAATCAACGACCGCATATT?-3’?????