[發明專利]一種抗腫瘤血管生成的適體分子及制備方法

有效

• 申請號: 201110375859.7
• 申請日: 2011-11-22
• 公開（公告）號: CN102533771A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 楊會勇;刁勇;林俊生;楊麗
• 申請（專利權）人: 華僑大學
• 主分類號: C12N15/115
• 分類號: C12N15/115;C12N15/10;A61P35/00
• 代理公司: 泉州市文華專利代理有限公司 35205
• 代理人: 戴中生

技術領域

本發明涉及一種抗腫瘤血管生成的適體分子及制備方法。

背景技術

適體是功能相當于抗體的DNA或RNA片段，能夠對靶分子進行特異性識別和結合，并有效抑制靶分子的生物學活性。適體的核酸序列信息可通過配體指數級富集系統進化技術(SELEX)篩選得到，適體分子能夠采用化學方法大批量低成本合成。DNA適體分子在體外非常穩定，凍干粉狀態常溫可保存一年以上，因此有很好的藥物開發前景。目前適體被認為是最有開發前景的核酸藥物之一，其它三種是RNAi、核酶和microRNA。適體分子與細胞外靶分子作用即有效，因此相對必須在細胞內發揮作用的其它三種核酸藥物，適體的應用前景更為廣泛。目前針對血液疾病、心血管疾病、神經系統疾病、血液系統疾病、腫瘤等疾病的診斷與治療方面的適體研究已經在進行中，一些適體制劑已經進入臨床試驗，專門用于治療黃斑變性的抗血管內皮生成因子(vascular?endothelial?growth?factor，VEGF)適體藥物(Macugen)已經上市。

適體藥物體內血清穩定性差的特點嚴重阻礙了其臨床應用。由于血液中存在核酸酶，特別是核酸外切酶，使得未加任何修飾的線性DNA或RNA分子的半衰期不到10分鐘，適體還未發揮理想的藥效作用即被降解。因此要開發適體藥物，首先需要考慮的就是如何延長其血液半衰期。當前廣泛使用的方式一般有兩種：一是對組成核酸適體分子的核苷酸進行分子骨架修飾，比如保護性2-位核苷酸修飾(2-F，2-OCH3，LNA，磷酸基團)等。盡管經化學基團修飾的適體分子顯示了良好的抗核酸外切酶特性，但是核苷酸骨架的化學修飾有時候影響適體對配體分子的親合力以及識別的特異性，適體分子代謝后產生的化學修飾核苷酸也可能參與人體核酸的合成，存在潛在的危害。第二種就是對適體分子進行環化修飾。由于血清中主要核酸酶為核酸外切酶，環化適體分子沒有暴露的5′端和3′端，核酸外切酶降解的直接源頭被消除，因此適體分子環化修飾可有效延長其血清穩定性。環化適體由于全部采用天然的常用核苷酸，避免了適體代謝后產生有潛在危害產物的風險。

目前環化適體的產生，主要是通過體外酶連的方法，以及利用質粒體內產生環化適體，存在效率低，操作復雜的問題。如何既保持經SELEX篩選出的核酸適體分子對配體特異性識別并與之結合的特性，又提高其體內穩定性，還沒有系統和成熟的方法。因此，發展一種快速高效和低成本的環狀適體制備的方法，對于拓寬核酸適體的應用有著及其重要的意義。本發明針對當前適體藥物存在的問題，開發了一種能夠高效率和低成本的適體環化修飾和制備的方法。

發明內容

針對當前適體藥物存在的問題，本發明建立了針對線性DNA適體分子進行環化修飾設計和制備的方法流程，通過改進的滾環擴增(rolling?circle?amplification，RCA)反應產生環狀DNA適體分子，建立了一種可高效快速和低成本的抗腫瘤血管生成的適體分子環化修飾設計及制備方法流程。

DNA適體分子的核酸序列是適體研究中最為重要的部分，核酸序列決定著適體的二級結構以及與配體分子識別的特異性和結合能力，大多數適體如果直接對線性分子進行環化則不能保持其原有構象，從而失去或大大減弱其識別與結合配體分子的能力。本發明依據經SELEX篩選出的線性DNA適體序列，經過構象分析和核心序列確定，設計了本發明的環狀DNA適體序列。

DNA適體分子環化技術目前存在著成本高和效率低的問題，本發明借鑒RCA方法，在輔助序列設計、試劑的選擇、擴增條件等方面進行改進，建立了一種可快速高效、低成本地產生包含豐富莖環結構的環狀適體的技術流程。經過兩次RCA反應可使初始環狀模板分子增加約10萬倍。

本發明簡寫說明如下：

VE5a：經SELEX技術篩選出的可作用于VEGF165的線性適體序列；

cVE5a：VE5a適體分子序列不加任何改動直接環化后的序列；

V5aE+：加入AT接頭序列及酶切位點序列的VE5a線性適體分子；

p-V5aE+：V5aE+5′端磷酸化后的序列；

V5aE-：V5aE+的反向互補序列；

cV5aE+：V5aE+的環化適體分子；

cV5aE-：V5aE-的環化適體分子，cV5aE+的反向互補序列；

LV5aE+：V5aE+的酶連輔助序列；

LV5aE-：V5aE-的酶連輔助序列；

DV5aE+：cV5aE+的酶切輔助序列；