[發(fā)明專利]一種抗腫瘤血管生成的適體分子及制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110375859.7
• 申請(qǐng)日: 2011-11-22
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102533771A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-07-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊會(huì)勇;刁勇;林俊生;楊麗
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華僑大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/115
• 分類號(hào): C12N15/115;C12N15/10;A61P35/00
• 代理公司: 泉州市文華專利代理有限公司 35205
• 代理人: 戴中生

1.一種抗腫瘤血管生成的適體分子，其特征在于，其序列為：5′-ACTTCCAGTCTATTCAATTGGGCCCGTCCGTATGGTGGGTGTGCGTGGCCACGAGTTTTAAAAAAAAAAACCAAGCTTTTTTTTGATCATGT-3′；該適體分子(V5aE+)在離適體分子與靶分子抗VEGF165特異結(jié)合的核心莖環(huán)區(qū)域較遠(yuǎn)的位置插入一個(gè)AT接頭和一個(gè)核酸酶作用位點(diǎn)，其中AT接頭中A和T堿基的數(shù)目分別是8個(gè)；酶作用位點(diǎn)包含DNA連接酶酶連位點(diǎn)以及DNA內(nèi)切酶(RsaI)酶切位點(diǎn)，位置在核心莖環(huán)區(qū)域與AT接頭之間，環(huán)化修飾的分子可通過(guò)環(huán)到環(huán)循環(huán)反應(yīng)大量制備，環(huán)化效率通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量RCA檢測(cè)。

2.一種如權(quán)利要求1所述的抗腫瘤血管生成的適體分子的制備方法，其特征在于包括如下步驟：首先對(duì)環(huán)化適體分子V5aE+進(jìn)行磷酸化和環(huán)化反應(yīng)，然后進(jìn)入環(huán)到環(huán)循環(huán)反應(yīng)；每次環(huán)到環(huán)循環(huán)反應(yīng)經(jīng)歷兩輪反應(yīng)，每輪反應(yīng)依次為滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)、酶切反應(yīng)和環(huán)化反應(yīng)。

3.如權(quán)利要求2所述的一種抗腫瘤血管生成的適體分子的制備方法，特征在于：所述的環(huán)化反應(yīng)使用的酶連輔助序列LV5aE+5′-CCCAATTGAATAGACTGGAAGTACATGATCAAAAAAAAGCT-3′；或酶連輔助序列LV5aE-為5′-AGCTTTTTTTTGATCATGTACTTCCAGTCTATTCAATTGGG-3′。

4.如權(quán)利要求2所述的一種抗腫瘤血管生成的適體分子的制備方法，其特征在于：所述的滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)使用的引物序列即酶連輔助序列LV5aE+為：5′-CCCAATTGAATAGACTGGAAGTACATGATCAAAAAAAAGCT-3′；或酶連輔助序列LV5aE-為：5′-AGCTTTTTTTTGATCATGTACTTCCAGTCTATTCAATTGGG-3′。

5.如權(quán)利要求2所述的一種抗腫瘤血管生成的適體分子的制備方法，其特征在于：所述的酶切反應(yīng)使用的酶切輔助序列DV5aE+為5′-GAATAGACTGGAAGTACATGATC-3′；或酶切輔助序列DV5aE-：5′-GATCATGTACTTCCAGTCTATTC-3′。

6.如權(quán)利要求2或3所述的一種抗腫瘤血管生成的適體分子的制備方法，其特征在于所述的環(huán)化反應(yīng)條件為：將1份待環(huán)化的磷酸化線性適體與1-5份酶連輔助序列混合，在Taq?DNA連接酶緩沖液中，95℃孵育5分鐘，然后緩慢冷卻到室溫；加入Taq?DNA連接酶，94℃孵育4分鐘；然后按照以下程序完成15個(gè)循環(huán)：94℃30秒，45℃5分鐘；最后95℃15分鐘滅活Taq?DNA連接酶；未環(huán)化的DNA產(chǎn)物用exoI+exoIII降解：上述環(huán)化反應(yīng)產(chǎn)物混合物，加入Exo?I和Exo?III，37℃孵育30分鐘，80℃孵育5分鐘滅活外切酶，得到環(huán)化DNA適體分子。

7.如權(quán)利要求2或4所述的一種抗腫瘤血管生成的適體分子的制備方法，其特征在于所述的滾環(huán)擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：將1份環(huán)化DNA分子與10-1000份的酶連輔助序列混合，加入到Bst?DNA聚合酶緩沖液中，再加入2百萬(wàn)份dNTPs，再加入Bst?DNA聚合酶，65℃120分鐘；80℃孵育20分鐘滅活Bst?DNA聚合酶。

8.如權(quán)利要求2或5所述的一種抗腫瘤血管生成的適體分子的制備方法，其特征在于所述的酶切反應(yīng)的反應(yīng)條件為：將1份RCA產(chǎn)物與10萬(wàn)份酶切輔助序列加入到RsaI內(nèi)切酶緩沖液中，再加入RsaI限制性內(nèi)切酶，37℃孵育3.0小時(shí)；65℃20分鐘滅活RsaI內(nèi)切酶。