[發(fā)明專利]一種萵苣原生質(zhì)體的提取方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110375704.3
• 申請日: 2011-11-23
• 公開（公告）號: CN102433294A
• 公開（公告）日: 2012-05-02
• 發(fā)明（設計）人: 王曉軍;王卉;寧慧霞;劉敏;郝秀英;努爾波拉提;徐琴
• 申請（專利權）人: 中國科學院新疆理化技術研究所
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04
• 代理公司: 烏魯木齊中科新興專利事務所 65106
• 代理人: 張莉

技術領域

本發(fā)明涉及植物原生質(zhì)體技術工程領域，具體涉及一種萵苣原生質(zhì)體的提取方法。

背景技術

萵苣(Lactuca?sativa?L.)為一年或者兩年生草本植物,屬菊科萵苣屬,萵苣可分為莖用和葉用兩種類型。莖用萵苣肉質(zhì)鮮嫩，可生食、涼拌、炒食、干制或腌制；葉用萵苣主要食用葉片或葉球。萵苣含有豐富的胡蘿卜素、硫胺素、核黃素以及鈣、磷、銅、碘、錳等礦物質(zhì)營養(yǎng)，碳水化合物的含量較低，而無機鹽、維生素則含量較豐富，尤其煙酸的含量頗豐，系胰島素激活劑，糖尿病患者食之有益；萵苣中鉀離子含量為鈉鹽的27倍，有利于體內(nèi)水鹽平衡，對于高血壓、心臟病患者有益，具有降低血壓和預防心率紊亂的作用。萵苣葉綠素能滋潤皮膚，清潔口腔；萵苣還有增進食欲、刺激消化液分泌、促進胃腸蠕動等功能。萵苣內(nèi)含有多種重要化學物質(zhì)，能中和消化過程中所產(chǎn)生的酸，有利于消化器官更好地吸收食物營養(yǎng)。生食萵苣，其Vc不致被破壞，有利于人體健康。萵苣葉的營養(yǎng)成分超過其莖部，被美食家譽為“綠色精靈”。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，萵苣中的一種芳香烴羥化脂，能夠分解食物中的致癌物質(zhì)亞硝胺，對于肝癌、胃癌癌細胞的形成有一定的預防作用，也可減輕癌癥患者放療或化療的反應。

萵苣廣泛栽培于世界各地，已成為人們喜愛的主要蔬菜。在一定程度上對萵苣進行種質(zhì)創(chuàng)新，同樣適應現(xiàn)代化社會發(fā)展的需求。通過原生質(zhì)體培養(yǎng)能得到由單細胞衍生出來的體細胞克隆，這是植物篩選高產(chǎn)，穩(wěn)定細胞系的良好途徑。因為萵苣的原生質(zhì)體含有其個體的全部遺傳信息，在同一時間內(nèi)獲得的大量原生質(zhì)體在遺傳上是同質(zhì)的；原生質(zhì)體能夠克服性細胞的不親和障礙，便于進行遠緣體細胞雜交，從而獲得遠緣雜種；原生質(zhì)體可直接攝取外緣的DNA、細胞器、病毒、質(zhì)粒等，是進行遺傳轉化研究的理想受體，可以獲得轉基因萵苣；萵苣原生質(zhì)體培養(yǎng)過程中，會產(chǎn)生一些次生代謝物，在技術成熟的條件下可以分離提取；因此利用原生質(zhì)體培養(yǎng)途徑進行萵苣的種質(zhì)資源創(chuàng)新不失為一種可行且有效的途徑。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種萵苣原生質(zhì)體的提取方法，該方法由萵苣無菌苗的培養(yǎng)、原生質(zhì)體的質(zhì)壁分離、原生質(zhì)體的酶解以及原生質(zhì)體的純化四個步驟完成。該方法以提高萵苣原生質(zhì)體的活力，簡單易于操作，分離材料易于得到，酶解的方法簡單，去除細胞壁條件溫和，分離的原生質(zhì)體得率高，活性強，易于萵苣原生質(zhì)體的培養(yǎng)和植株再生，為原生質(zhì)體融合奠定了基礎。另外原生質(zhì)體的超低溫保存對于有優(yōu)良性狀的種質(zhì)資源的保存也有極其重要的價值。

本發(fā)明所述的一種萵苣原生質(zhì)體的提取方法，按下列步驟進行：

a、取萵苣種子，用自來水流動沖洗40-120?min，然后將種子在超凈工作臺上用75%酒精表面消毒10-60s，用0.1%升汞滅菌2-10?min，再用無菌水沖洗4-6次；

b、將步驟a中處理后的萵苣種子接入誘導培養(yǎng)基1/2MS，溫度20±1℃，光照2500-3000?lx，時間16?h/d，培養(yǎng)時間15-35d；

c、將步驟b中培養(yǎng)出的無菌苗，切碎后浸入原生質(zhì)體清洗液+13%甘露醇溶液中進行質(zhì)壁分離，在溫度25℃黑暗條件下，處理1-4小時；

d、將步驟c中的質(zhì)壁分離液慢慢倒出，將葉片置于pH5.4-6.2的酶液中，溫度20-28℃，轉速40-80rpm，黑暗條件下震蕩12-16小時進行酶解；

e、將步驟d中的葉片組織，用300-500目的細胞篩過濾，然后500r/min離心沉淀原生質(zhì)體，棄去上清液，加入原生質(zhì)體清洗液+13%甘露醇的清洗液混勻，進行原生質(zhì)體清洗，棄去上清液，將原生質(zhì)體的沉淀用移液槍吸出鋪在原生質(zhì)體清洗液+15-25%的蔗糖溶液上，1000r/min條件下離心5-10min,即可得到處于中間部分的萵苣原生質(zhì)體。

步驟b中的誘導培養(yǎng)基中含有蔗糖25-35g/L和瓊脂6-8g/L，pH值為5.8。

步驟d中所述酶液為：將原生質(zhì)體清洗液中加入重量百分比纖維素酶1-2%，離析酶0.2-0.8%,甘露醇9%-13%，2-（N-嗎啡啉）乙磺酸（MES）3-7mmol/L，慶大霉素0.1-0.5mg/L,四環(huán)素0.1-0.5mg/L,氨芐3-5mg/L混合均勻。

本發(fā)明所述方法簡單易于操作，分離材料易于得到，方法實用。酶解的方法簡單，去除細胞壁條件溫和，分離的原生質(zhì)體得率高，活性強，易于萵苣原生質(zhì)體的培養(yǎng)和植株再生，為原生質(zhì)體融合奠定了基礎。另外原生質(zhì)體的超低溫保存對于有優(yōu)良性狀的種質(zhì)資源的保存也有極其重要的價值。

附圖說明

圖1?為本發(fā)明酶解和純化后的萵苣原生質(zhì)體圖。

具體實施方式