[發明專利]一種萵苣原生質體的提取方法

無效

• 申請號: 201110375704.3
• 申請日: 2011-11-23
• 公開（公告）號: CN102433294A
• 公開（公告）日: 2012-05-02
• 發明（設計）人: 王曉軍;王卉;寧慧霞;劉敏;郝秀英;努爾波拉提;徐琴
• 申請（專利權）人: 中國科學院新疆理化技術研究所
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04
• 代理公司: 烏魯木齊中科新興專利事務所 65106
• 代理人: 張莉

1.一種萵苣原生質體的提取方法，其特征在于按下列步驟進行：

a、取萵苣種子，用自來水流動沖洗40-120?min，然后將種子在超凈工作臺上用75%酒精表面消毒10-60s，用0.1%升汞滅菌2-10?min，再用無菌水沖洗4-6次；

b、將步驟a中處理后的萵苣種子接入誘導培養基1/2MS，溫度20±1℃，光照2500-3000?lx，時間16?h/d，培養時間15-35d；

c、將步驟b中培養出的無菌苗，切碎后浸入原生質體清洗液+13%甘露醇溶液中進行質壁分離，在溫度25℃黑暗條件下，處理1-4小時；

d、將步驟c中的質壁分離液慢慢倒出，將葉片置于pH5.4-6.2的酶液中，溫度20-28℃，轉速40-80rpm，黑暗條件下震蕩12-16小時進行酶解；

e、將步驟d中的葉片組織，用300-500目的細胞篩過濾，然后500r/min離心沉淀原生質體，棄去上清液，加入原生質體清洗液+13%甘露醇的清洗液混勻，進行原生質體清洗，棄去上清液，將原生質體的沉淀用移液槍吸出鋪在原生質體清洗液+15-25%的蔗糖溶液上，1000r/min條件下離心5-10min,即可得到處于中間部分的萵苣原生質體。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟b中的誘導培養基中含有蔗糖25-35g/L和瓊脂6-8g/L，pH值為5.8。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟d中所述酶液為：將原生質體清洗液中加入重量百分比纖維素酶1-2%，離析酶0.2-0.8%,甘露醇9-13%，2-（N-嗎啡啉）乙磺酸3-7mmol/L，慶大霉素0.1-0.5mg/L,四環素0.1-0.5mg/L,氨芐3-5mg/L混合均勻。