[發(fā)明專利]一種大豆分離蛋白酶解產(chǎn)物中的天冬氨酸蛋白酶抑制劑的制備方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110375582.8
• 申請(qǐng)日: 2011-11-23
• 公開（公告）號(hào): CN102367467A
• 公開（公告）日: 2012-03-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 田亞平;張國強(qiáng)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12P21/06
• 分類號(hào): C12P21/06;C07K1/18
• 代理公司: 無錫市大為專利商標(biāo)事務(wù)所 32104
• 代理人: 時(shí)旭丹;劉品超

技術(shù)領(lǐng)域

一種大豆分離蛋白酶解產(chǎn)物中的天冬氨酸蛋白酶抑制劑的制備方法，具體說是采用木瓜蛋白酶在特定條件下酶解大豆分離蛋白，酶解液經(jīng)過熱處理，高速離心，DEAE-52離子交換層析，獲得純化的天冬氨酸蛋白酶抑制劑，屬于生物制品分離純化技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

酶制劑已廣泛應(yīng)用在食品、釀造、制藥、有機(jī)酸、淀粉糖、飼料工業(yè)、紡織、皮革、洗滌劑及保健品等各個(gè)領(lǐng)域，應(yīng)用領(lǐng)域越來越廣泛，食品與人們的生活密切相關(guān)，因此酶在食品工業(yè)中的應(yīng)用價(jià)值越來越重要，目前在烘焙、奶制品、肉類加工、新型營(yíng)養(yǎng)食品和蛋白質(zhì)的水解中得到很大的體現(xiàn)。

酶解蛋白質(zhì)生產(chǎn)多肽已成為當(dāng)今熱門研究，通過不同的酶切方式可以獲得不同功能的活性多肽，尤其是開發(fā)一些寡肽物質(zhì)，成為蛋白質(zhì)研究中的一個(gè)新領(lǐng)域。

天冬氨酸蛋白酶，屬于一種蛋白水解酶家族，廣泛分布于自然界，病毒、真菌、植物及動(dòng)物中均有存在。這個(gè)家族主要包括胃蛋白酶、組織蛋白酶D、蛋白酶A、血管緊張素原酶和艾滋病毒蛋白酶等，它們均含兩個(gè)高度保守的天冬氨酸殘基的活性位點(diǎn)。有些天冬氨酸蛋白酶已被證實(shí)參與某些病理過程，例如，艾滋病毒的復(fù)制過程中HIV-1蛋白酶起著重要作用，腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移也需求不同的蛋白酶。此外，他們參與許多生理過程，如：食品消化，溶酶體降解，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等，也可以調(diào)解感染性生物最初的入侵步驟，由于蛋白酶催化肽鍵水解基本上是不可逆轉(zhuǎn)的，因此，蛋白酶抑制劑廣泛的監(jiān)管網(wǎng)絡(luò)在確保蛋白酶的空間和時(shí)間上的精確活動(dòng)中起著重要作用。

蛋白酶抑制劑泛指對(duì)蛋白酶有抑制作用的一類物質(zhì)，能參與控制體內(nèi)蛋白的酶解活動(dòng)，對(duì)維持正常的生命活動(dòng)具有重要意義。已有研究發(fā)現(xiàn)一些天冬氨酸蛋白酶抑制劑對(duì)HIV和高血壓的臨床治療有益，在癌癥，肥胖，心血管疾病，炎癥，神經(jīng)退行性疾病以及各種傳染病和寄生蟲病中也有潛在的應(yīng)用價(jià)值。目前報(bào)道的天冬氨酸蛋白酶抑制劑多是通過化學(xué)法合成的，安全性得不到保證，因此研究從天然生物中提取的抑制劑將具有更大的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

我國動(dòng)植物蛋白的利用已經(jīng)有了很大的發(fā)展，如大豆蛋白、酪蛋白、乳清蛋白等已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用。作為三大作物之一的大豆，每年生產(chǎn)的大豆蛋白數(shù)量很大，且大豆分離蛋白中蛋白質(zhì)含量在90%以上，利用生物酶技術(shù)將提純后的蛋白水解，制備具有生物活性的多肽，是提高大豆蛋白附加值的另一種途徑。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的是提供大豆分離蛋白特定條件下酶解產(chǎn)物中一種天冬氨酸蛋白酶抑制劑的制備方法，采用木瓜蛋白酶在特定條件下酶解大豆分離蛋白，將酶解液進(jìn)行熱處理，高速離心獲得粗天冬氨酸蛋白酶抑制劑，再經(jīng)DEAE-52離子交換層析，獲得較純的天冬氨酸蛋白酶抑制劑，對(duì)胃蛋白酶（2800U）的半抑制濃度IC₅₀值約為56.5~58.6μg/mL，回收率75%~79%，對(duì)胃蛋白酶的最佳抑制反應(yīng)時(shí)間為20?min；在40℃～90℃范圍內(nèi)，胃蛋白酶抑制劑熱穩(wěn)定性良好；pH穩(wěn)定范圍為2～11。對(duì)其進(jìn)行底物特異性分析，知該抑制劑對(duì)同為天冬氨酸族蛋白酶的胃蛋白酶和凝乳酶都有較高的抑制活性，而對(duì)幾種屬于其它家族的蛋白酶（半胱氨酸族的木瓜蛋白酶、絲氨酸族的胰蛋白酶、金屬蛋白酶族的中性蛋白酶等）幾乎都沒有抑制活性。

本發(fā)明技術(shù)方案：一種大豆分離蛋白酶解產(chǎn)物中的天冬氨酸蛋白酶抑制劑的制備方法，采用木瓜蛋白酶在特定條件下酶解大豆分離蛋白，將酶解液進(jìn)行熱處理，高速離心，上清液經(jīng)DEAE-52離子交換層析得純化的天冬氨酸蛋白酶抑制劑，再經(jīng)真空冷凍干燥得天冬氨酸蛋白酶抑制劑干粉；其工藝為：

A篩選酶類優(yōu)化酶解條件：

（1）大豆分離蛋白：購自安陽漫天雪食品制造有限公司；

（2）酶解：配置質(zhì)量濃度5%的大豆分離蛋白溶液100?mL，分別用相同酶活單位（每克大豆分離蛋白加入的蛋白酶量為8000U）的木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、胰蛋白酶在各自最適溫度、pH條件下酶解相同的時(shí)間，結(jié)果如圖1所示，三種不同的蛋白酶酶解大豆分離蛋白200?min。峰a、b、c所對(duì)應(yīng)的抑制活性分別為：3.6、1.5、0.9?IU/mL。木瓜蛋白酶酶解大豆蛋白60?min，在峰a處對(duì)胃蛋白酶有最大的抑制活性。故選取木瓜蛋白酶酶解大豆分離蛋白60?min的產(chǎn)物為研究對(duì)象；

（3）木瓜蛋白酶酶解大豆分離蛋白：確定木瓜蛋白酶為酶解大豆分離蛋白的最適蛋白酶，酶解條件為：每克大豆分離蛋白加入的木瓜蛋白酶量為8000U，pH?6.5。55℃下水浴酶解60?min；

B大豆分離蛋白酶解后上清液的制備：