[發(fā)明專利]一種高產(chǎn)氨肽酶的重組大腸桿菌及其構(gòu)建方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110374404.3
• 申請日: 2011-11-22
• 公開（公告）號: CN102492646A
• 公開（公告）日: 2012-06-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 周哲敏;高新星;崔文璟
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/57;C12N15/70;C12R1/19
• 代理公司: 北京匯信合知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11335
• 代理人: 王秀麗

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明涉及一種高產(chǎn)氨肽酶的重組大腸桿菌及其構(gòu)建方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

氨肽酶是一類能夠水解蛋白質(zhì)和多肽N端氨基酸的外切蛋白水解酶，廣泛存在于動植物及微生物中。氨肽酶在許多生物加工過程中起著重要的作用，如蛋白質(zhì)的消化和分解、蛋白質(zhì)的成熟、激素分泌的調(diào)節(jié)及細胞周期的控制。毫無疑問，許多疾病的引發(fā)都與氨肽酶有關(guān)，包括炎癥、白內(nèi)障、糖尿病、中風(fēng)、囊性纖維化甚至癌癥和艾滋病等。因此，正確了解氨肽酶的催化機制以及一些影響氨肽酶發(fā)揮正常生物學(xué)功能的因素對預(yù)防和治療這些疾病有著重要的作用。

目前，微生物發(fā)酵生產(chǎn)氨肽酶存在產(chǎn)量低的問題，如何提高微生物法生產(chǎn)氨肽酶的產(chǎn)量成為迫切需要解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供：一種高效表達氨肽酶的重組大腸桿菌，是將來源于枯草芽孢桿菌Zj016的去除了信號肽的氨肽酶基因?qū)隕.coli?BL21(DE3)得到的基因工程菌。

所述枯草芽孢桿菌Zj016，詳見田亞平，須瑛敏。一種枯草芽孢桿菌氨肽酶的純化及酶學(xué)性質(zhì)[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2006，32(3)：7-10.

所述去除了信號肽的氨肽酶核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題是提供一種所述高效表達氨肽酶的大腸桿菌基因工程菌的構(gòu)建方法。

為解決上述技術(shù)問題，步驟如下：

1)收集枯草芽孢桿菌Zj016分泌的純酶進行N端氨基酸序列測定；

2)將測得的氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中比對，根據(jù)與其一致性最高蛋白的核苷酸序列并設(shè)計引物P1和P2克隆氨肽酶基因，將所述氨肽酶基因轉(zhuǎn)化E.coli?JM109，得到重組質(zhì)粒PUC19-SAP；

3)分析氨肽酶核苷酸序列，設(shè)計引物P3和P4克隆出不含信號肽的編碼成熟氨肽酶的基因；將所述成熟氨肽酶的基因與載體pET-28a(+)連接，挑選陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli?BL21(DE3)。

所述引物P1核苷序列如SEQ?ID?NO.2所示。

所述引物P2核苷序列如SEQ?ID?NO.3所示。

所述引物P3核苷序列如SEQ?ID?NO.4所示。

所述引物P4核苷序列如SEQ?ID?NO.5所示。

本發(fā)明提供了一種高產(chǎn)氨肽酶的重組大腸桿菌及其構(gòu)建方法，該方法簡單有效，構(gòu)建的重組大腸桿菌能高效表達氨肽酶，能為后期研究氨肽酶的特性、結(jié)構(gòu)等提供所需蛋白。

附圖說明：

圖1：野生菌純酶N端測序結(jié)果。

圖2：枯草芽孢桿菌氨肽酶基因的克隆結(jié)果(1：目的基因)。

圖3：重組質(zhì)粒PUC19-SAP雙酶切結(jié)果，(1：PUC19，2：目的基因)。

圖4：重組質(zhì)粒pET-28a(+)-AP雙酶切結(jié)果(1：pET-28a(+)；2：目的基因)。

圖5：重組大腸桿菌表達SDS-PAGE結(jié)果(M：marker；1：未誘導(dǎo)；2：誘導(dǎo)；3：目的蛋白)。

具體實施方式：

材料和檢測方法

LB培養(yǎng)基：：1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％氯化鈉，pH?7.0。

TB培養(yǎng)基：1.2％胰蛋白胨，2.4％酵母提取物，0.4％甘油，17mM?KH₂PO₄，72mMK₂HPO₄。

氨肽酶活性測定方法：以L-亮氨酸-對硝基苯胺為底物，在50mM?pH?8.5的Tris-HCl緩沖液中加入稀釋一定倍數(shù)的酶液和底物(1mM)，50℃水浴反應(yīng)10min，在405nm下測定吸光度。酶活單位定義：在50℃下，1min分解L-亮氨酸-對硝基苯胺產(chǎn)生1μM對硝基苯胺所需的酶量為一個酶活單位(1U)。

實施例1：