[發(fā)明專利]一種高產(chǎn)氨肽酶的重組大腸桿菌及其構(gòu)建方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110374404.3
• 申請(qǐng)日: 2011-11-22
• 公開（公告）號(hào): CN102492646A
• 公開（公告）日: 2012-06-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周哲敏;高新星;崔文璟
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12N15/57;C12N15/70;C12R1/19
• 代理公司: 北京匯信合知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11335
• 代理人: 王秀麗

1.一種生產(chǎn)氨肽酶的重組大腸桿菌，是將來源于枯草芽孢桿菌Zj016的編碼成熟氨肽酶基因?qū)隕.coli?BL21(DE3)得到的基因工程菌。

2.如權(quán)利要求1所述基因工程菌，其特征在于，所述編碼成熟氨肽酶基因是去除了31個(gè)氨基酸的信號(hào)肽的氨肽酶基因，核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

3.一種權(quán)利要求1所述生產(chǎn)氨肽酶的重組大腸桿菌的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟如下：

1)收集枯草芽孢桿菌Zj016分泌的純酶進(jìn)行N端氨基酸序列測定；

2)將測得的氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中比對(duì)，根據(jù)與其一致性最高蛋白的核苷酸序列并設(shè)計(jì)引物P1和P2克隆氨肽酶基因，將所述氨肽酶基因轉(zhuǎn)化E.coli?JM109，得到重組質(zhì)粒PUC19-SAP；

3)分析氨肽酶核苷酸序列，設(shè)計(jì)引物P3和P4克隆出不含信號(hào)肽的編碼成熟氨肽酶的基因；將所述成熟氨肽酶的基因與載體pET-28a(+)連接，挑選陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli?BL21(DE3)。

4.如權(quán)利要求3所述方法，其特征在于，具體步驟如下：

1)將枯草芽孢桿菌Zj016分泌的純酶進(jìn)行SDS-PAGE電泳后，從玻璃板上取下凝膠，去除所有濃縮膠，將凝膠浸入電轉(zhuǎn)緩沖液中30min；濾紙?jiān)陔娹D(zhuǎn)緩沖液中浸泡1min；PVDF膜在甲醇中浸泡15s后將膜放于雙蒸水中5min，放于轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡10min；然后打開轉(zhuǎn)移夾子，黑孔板朝下，將泡沫墊子、濾紙、凝膠、膜、濾紙、泡沫墊子按順序放入夾子中；將轉(zhuǎn)移夾放入轉(zhuǎn)移槽中，黑孔板面對(duì)準(zhǔn)支撐板的負(fù)極，白孔板對(duì)準(zhǔn)支撐板的正極；在轉(zhuǎn)移槽中加入適量緩沖液至轉(zhuǎn)移槽全部浸沒；將電轉(zhuǎn)槽放在冰水浴中進(jìn)行電轉(zhuǎn)，電流：恒流85mA，2h即可；轉(zhuǎn)移完成后用鑷子從槽中取出膜，在雙蒸水中漂洗膜，然后浸入甲醇數(shù)秒，放入染色液中染色30-60s；然后放置脫色液中進(jìn)行脫色至背景無蘭色；用雙蒸水漂洗膜，置膜于濾紙自然干燥，剪下目的條帶，送測序；

2)將測得的氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中BLAST，查找出與其一致性最高的蛋白的基因；利用同源性最高的基因設(shè)計(jì)引物，提取枯草芽孢桿菌Zj016基因組并以其作為模板，克隆目的基因；PCR體系為：10μM引物P1和P2各1μL，2mM?dNTPS?5μL，10×KOD-Plus-NeoBuffer?5μL，1U/μL的KOD-Plus-Neo?DNA聚合酶1μL，模板0.5μL，加雙蒸水補(bǔ)齊50μL；PCR條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min?30s，30個(gè)循環(huán)；將PCR產(chǎn)物和載體PUC19分別進(jìn)行雙酶切并切膠回收，于16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化E.coliJM109，在含有氨芐抗性的LB平板挑取3個(gè)轉(zhuǎn)化子，提取重組質(zhì)粒并進(jìn)行PCR和雙酶切驗(yàn)證后送上海生工測序，重組質(zhì)粒即PUC19-SAP；

3)根據(jù)測得的DNA序列分析，目的基因編碼成熟氨肽酶和一個(gè)含有31個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，設(shè)計(jì)另一對(duì)引物，以重組質(zhì)粒PUC19-SAP為模板，克隆不含信號(hào)肽的目的基因，PCR體系和條件同上；將PCR產(chǎn)物和空載體pET-28a(+)分別進(jìn)行雙酶切并切膠回收，于16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化E.coli?JM109，在含有卡那抗性的LB平板挑取轉(zhuǎn)化子，提取重組質(zhì)粒并進(jìn)行PCR和雙酶切驗(yàn)證后測序，重組質(zhì)粒即pET-28a(+)-AP；將陽性克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)，在含有卡那抗性的LB平板挑取單菌落做表達(dá)驗(yàn)證。