[發明專利]抗結核抑制劑篩選的靶標基因Rv0233及應用

無效

• 申請號: 201110373823.5
• 申請日: 2011-11-21
• 公開（公告）號: CN103123672A
• 公開（公告）日: 2013-05-29
• 發明（設計）人: 何正國;崔濤;曾菊梅
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: G06F19/16
• 分類號: G06F19/16;C12Q1/18;C12R1/32
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 張紅兵

技術領域

本發明屬于藥物分子學技術領域，具體涉及一種結核分枝桿菌基因Rv0233在篩選抗結核抑制劑靶標中的應用。?

背景技術

結核分枝桿菌是一種嚴重危害人類健康的病原菌，據世界衛生組織統計，全世界每年大約有三百萬人死于結核病，并且全球約有三分之一的人口感染處于潛伏狀態的結核分枝桿菌(WHO，2009)。目前，結核病化學療法有一線和二線藥物的混合劑構成。實際的結核病治療需要6～9個月，導致了嚴重的毒性和抗藥性。從引進抗結核藥物時便不斷出現抗藥性結核分枝桿菌菌株。事實上，由于具有不尋常的細胞壁，分枝桿菌天然地對大多數常用抗生素具有抗性。此外，遺傳學改變也使其獲得抗藥性。由于結核分枝桿菌菌株對越來越多的用于治療多重抗藥性結核病(multidrug-resistant?tuberculosis，MDR-TB)的二線藥物產生抗性，因此其已成為世界范圍公共健康的威脅(Gandhi?et?al，2010)。近年來出現的藥物抗性菌株以及與HIV的共感染問題，使得這一形式更加嚴峻。因此，尋找新的藥物靶標并研發新的抗結核藥物和診斷工具已經迫在眉睫(Ginsberg?and?Spigelman，2007)。特別地，需要具有新作用機制的對抗藥性菌株具有活性的新藥物。相應地，還存在鑒定新藥物靶標的迫切要求。?

在研發新的抗結核藥物中，常規的篩選方法是使用化合物庫進行批量篩選，在Bryk?R及其同事的相關工作中，抑菌試驗一共使用了15,000個化合物(Bryk?R?et?al，2008)，工作量大，費錢費力，結核分枝桿菌是一種病原菌，無法常規操作，需要尋找特異性好，命中率高的抑制劑。目前在結核分枝桿菌中基于結構的藥物設計是研發新的抗結核藥物的有效手段，但是相關的研究只進行到篩選出潛在的藥物小分子，沒有進行抑菌試驗(Cui?T?at?al，2009；Dube?D?et?al，2008)，導致無法評估所篩選到的小分子是否具有潛在的應用價值。?

結核分枝桿菌Rv0233基因編碼核苷酸還原酶(NrdB；EC：1.17.4.1)，催化由核糖核酸形成脫氧核糖核酸的反應(Mowa?MB?et?al，2009)。目前已經獲得Rv0233蛋白質與肉豆蔻酸共結晶的晶體結構(PDB?ID：3EE4)(Mowa?MB?et?al，2009).在本發明中，Rv0233蛋白質結合肉豆蔻酸的活性空腔被選作對接化合物的活性位點。將有致病性的結核分枝桿菌H37Rv菌株與無致病性的BCG卡介苗相比，結核分枝桿菌Rv0233蛋白是差異表達的基因中上調最高的，上調倍數達7倍之多(Schmidt?F?et?al，2004)。這說明Rv0233基因的表達可能與結核分枝桿菌的致病性密切相關，它是潛在的作為藥物靶標的理想選擇。然而，到目前為止，尚未有人報道具有抗結核效應的Rv0233的抑制劑。?

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的缺陷，通過分子設計方法，獲得一種新的結核病治療藥物的靶標。本發明的另一個目的是針對Rv0233天然底物結合位點篩選的小分子化合物抑?菌試驗中確實能起到抑菌作用。確定結核分枝桿菌中的Rv0233是一種合適的抗結核抑制劑篩選的靶標。?

本發明是這樣實現的：首先通過運行分子對接程序來從小分子化合物數據庫中篩選與Rv0233天然底物結合位點具有高親和力的小分子化合物。本發明獲取結核分枝桿菌Rv0233的蛋白質序列(編碼該蛋白質的序列可以從Http://genolist.pasteur.fr/TubercuList(TubercuList萬維服務器；Rv0233基因坐標：從278585到279529獲得)，其全長包含314個氨基酸殘基。目前已經獲得Rv0233與肉豆蔻酸共結晶的晶體結構(PDB?ID：3EE4)(Mowa?MB?et?al，2009).在本發明中，Rv0233結合肉豆蔻酸的活性空腔被選作對接化合物的活性位點。利用所獲得的三維結構信息和活性位點信息，在計算機上構建了一個針對結核分枝桿菌Rv0233的計算機輔助藥物篩選系統，然后運用該系統從小分子化合物數據庫中篩選與之活性位點有高親和力的化合物分子。?

其次，本發明測定了小分子抑制劑對結核分枝桿菌的抑菌作用。為了確定哪些抑制劑分子具有抑菌活性，將50μg/ml的候選抑制劑添加到結核分枝桿菌的細菌培養物中。將添加了抑制劑的細菌培養物于37℃培養7～8天，通過讀取各OD值并與對照進行比較來判斷細菌生長是否受到抑制。其中對照1是不用抑制劑的處理，對照2是使用利福平處理，實驗過程中的數據是與兩個對照比較來評價利用所述候選抑制劑得到的抑制效果，?