[發(fā)明專利]一種血漿中多胺類物質(zhì)的測(cè)定方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110373078.4
• 申請(qǐng)日: 2011-11-22
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102426210A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-04-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李清;畢開(kāi)順;劉然;賈英;尹然
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 沈陽(yáng)藥科大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N30/88
• 分類號(hào): G01N30/88;G01N30/06
• 代理公司: 沈陽(yáng)杰克知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 21207
• 代理人: 李宇彤

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種血漿中多胺類物質(zhì)的測(cè)定方法，更確切地說(shuō)是一種對(duì)血漿中多胺類物質(zhì)進(jìn)行高效靈敏定量測(cè)定的方法。?

背景技術(shù)

多胺是一類小分子脂肪胺類化合物，帶有兩個(gè)或兩個(gè)以上伯胺基與仲胺基，通常指1,3-丙二胺、腐胺、尸胺、精脒、精胺等。多胺在生物體內(nèi)廣泛存在，參與基因表達(dá)和翻譯的調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖等生命活動(dòng)過(guò)程，與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。?

目前對(duì)體內(nèi)內(nèi)源性物質(zhì)多胺的定量測(cè)定主要有液相色譜-熒光衍生化法、液相色譜-紫外衍生化法、免疫法和液相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)法幾種。液相色譜-熒光衍生化法具有靈敏的特點(diǎn)，但其它內(nèi)源性物質(zhì)易干擾其測(cè)定，專一性較差難以滿足高水平臨床研究的需要；液相色譜-紫外衍生化法具有專一的特點(diǎn)，但靈敏度又很難適合體內(nèi)低濃度的多胺測(cè)定；免疫法雖操作相對(duì)簡(jiǎn)便，但對(duì)各多胺分離能力差，測(cè)定交叉干擾嚴(yán)重，且實(shí)施價(jià)格較高，對(duì)臨床后續(xù)研究性價(jià)值不高。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)具有專一性強(qiáng)、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，在體內(nèi)藥物分析、內(nèi)源性物質(zhì)測(cè)定分析和代謝組學(xué)相關(guān)領(lǐng)域方面已有成熟的應(yīng)用，是近年來(lái)應(yīng)用迅速發(fā)展的分析測(cè)試技術(shù)。?

由于多胺是小分子化合物，具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、在體內(nèi)含量低的特點(diǎn)，而臨床檢測(cè)需建立快速、靈敏、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)的測(cè)定方法，因此實(shí)際能夠應(yīng)用在臨床上的多胺檢測(cè)方法目前尚未完全建立。?

發(fā)明內(nèi)容

本文目的是采用簡(jiǎn)便的預(yù)處理方法、靈敏的檢測(cè)手段，建立血漿中多胺的分析方法，實(shí)現(xiàn)血漿中痕量多胺的檢測(cè)，使多胺在癌癥的預(yù)診、治療評(píng)價(jià)以及在抗癌藥物的開(kāi)發(fā)研究中發(fā)揮重要作用。?

本發(fā)明所述多胺類物質(zhì)優(yōu)選腐胺、1,3-丙二胺、尸胺、精胺、精脒。?

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的：?

（1）血樣本預(yù)處理：

a．取一定量采集的血漿，加入一定量?jī)?nèi)標(biāo)溶液及一定量高氯酸、酸性甲醇或三氯醋酸溶液，渦旋混勻后，高速離心取上清液；

b．取經(jīng)a步驟處理后的上清液，加入衍生化試劑、堿化試劑，渦旋混勻，在超聲條件下反應(yīng)后加入中止反應(yīng)試劑、萃取溶劑后震蕩，上層有機(jī)溶液轉(zhuǎn)移吹干，加入甲醇超聲離心后取上清液，進(jìn)行LC?-MS分析。

（2）?液相分離：?

a．采用C₁₈作固定相，

b．流動(dòng)相A：甲醇，流動(dòng)相B：水。

????梯度洗脫并控制流速?

（3）??MS?測(cè)定：

電噴霧離子源，正離子掃描。

步驟（1）a操作中，內(nèi)標(biāo)溶液優(yōu)選物質(zhì)量濃度為500ng/ml的1,6-已二胺，高氯酸的質(zhì)量濃度優(yōu)選5%-9%，酸性甲醇的質(zhì)量濃度優(yōu)選1%-5%，三氯醋酸質(zhì)量濃度優(yōu)選5%-9%。?

步驟（1）b操作中，衍生化試劑、堿化試劑的加入順序優(yōu)選先加入堿化試劑，后加入衍生化試劑。?

步驟（1）b操作中，堿化試劑優(yōu)選0.5?mol/L至2?mol/L氫氧化鈉溶液，?

步驟（1）b操作中，衍生化試劑為苯甲酰氯溶液和乙腈的混合溶液，苯甲酰氯質(zhì)量濃度優(yōu)選1%-5%。

步驟（1）b操作中，超聲反應(yīng)時(shí)的溫度優(yōu)選30^oC。?

步驟（1）b操作中，中止反應(yīng)試劑優(yōu)選飽和氯化鈉溶液。?

步驟（1）b操作中，萃取溶劑優(yōu)選乙醚。?

步驟（2）中梯度洗脫優(yōu)選14分鐘內(nèi)甲醇體積濃度由55?%上升到74?%，控制流速優(yōu)選在0.8?ml/min-1.2?ml/min，柱溫優(yōu)選20?^oC-40^?oC，進(jìn)樣體積優(yōu)選5?μL-15?μL。?

步驟（3）中，質(zhì)譜條件優(yōu)選毛細(xì)管電壓：4200-4500?V，霧化氣流速:?1.1-1.3?Bar，干燥氣流速:?5.0-7.0?L???min^-1，干燥氣溫度:?210-230?^oC，掃描范圍:?50-900?m/z，定量離子:?1,3-丙二胺?m/z:?303.1，腐胺?m/z:?319.1，尸胺?m/z:?333.2，1,6-已二胺(內(nèi)標(biāo))m/z:?347.2，精脒?m/z:?480.2，精胺?m/z:?641.3。?